孫小草,張 強,章秀梅,劉叢彬,俞年軍,2,謝冬梅,2
(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院,安徽 合肥 230012;2.安徽省中醫(yī)藥科學院中藥資源保護與開發(fā)研究所,安徽 合肥 230012)
變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是機體接觸變應原后由免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介導的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病,其典型癥狀為陣發(fā)性噴嚏、鼻癢和鼻塞、流涕等[1]。AR的發(fā)病機制復雜,現(xiàn)代研究認為其主要是免疫調(diào)節(jié)細胞Th1與Th2比例失衡引起的變應性炎癥疾病。當Th1細胞釋放的干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)等細胞因子不足時,Th2細胞會出現(xiàn)亢進現(xiàn)象,產(chǎn)生大量的白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等細胞因子,從而引起IgE過量,引起AR[2-3]。目前臨床治療AR的藥物種類有糖皮質(zhì)激素類、抗組胺類、抗白三烯類等,其中抗組胺類藥物具有良好的安全性、較少的不良反應等優(yōu)點而成為臨床常用藥,如氯雷他定、依巴斯汀[3-5]。
蒼耳子(Xanthii Fructus)為菊科植物蒼耳(XanthiumsibiricumPatr.)的干燥成熟帶總苞的果實,具有散風寒、通鼻竅、祛風濕的功效[6]。在治療鼻炎、鼻竇炎及AR的30種臨床常用中藥方劑中,含有蒼耳子的有23種,且均作為君藥或臣藥使用,如以蒼耳子為君藥的蒼耳子散對小兒AR具有治療作用[7]。由蒼耳子揮發(fā)油制備的蒼耳油滴鼻劑有明顯的降低AR豚鼠血清IgE水平,修復鼻黏膜結構的作用[8]。此外,研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子中含有的咖啡奎寧酸類化合物可能為抗炎鎮(zhèn)痛的主要活性成分之一,其水提取物有抗過敏活性[9]。本實驗通過復制AR豚鼠模型,觀察中藥蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻部行為學癥狀、鼻黏膜組織病理變化以及血清炎癥細胞因子水平的影響,為蒼耳子治療AR提供實驗依據(jù)。
1.1 動物及分組 SPF級豚鼠70只,體質(zhì)量200~240 g,購于南京市江寧區(qū)青龍動物繁殖場[生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2012-0008]。將豚鼠隨機分為正常組,模型組,氯雷他定組(2 mg/kg),玉屏風散組(3 g/kg),蒼耳子水提取物高劑量(4 g/kg,相當于成人臨床用量的6倍)、中劑量(2 g/kg)、低劑量(1 g/kg)組,每組10只,雌雄各半。
1.2 藥物與試劑 中藥蒼耳子于2017年10月采自北京市朝陽區(qū)長鄉(xiāng)店,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學方成武教授鑒定為菊科植物蒼耳(XanthiumsibiricumPatr.)成熟帶總苞的果實。采用水提取法[10]制備,濾液加熱濃縮至濃度為0.4 g/mL,備用;將氯雷他定片溶于蒸餾水,制成2 mg/mL的溶液;將玉屏風散溶于蒸餾水,制成3 g/mL的溶液。
卵蛋白(ovalbumin,OVA;批號 926A034):北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鋁(批號 21645-51-2):上海麥克林生化科技有限公司;氯雷他定(批號 180225073):西安楊森制藥有限公司;玉屏風顆粒(批號 ZFB1704):云南白藥集團股份有限公司;IgE、IL-4、IFN-γ ELISA檢測試劑盒(批號分別為20180516、20180522、201800426):北京安迪華泰科技有限公司。
1.3 儀器 MSS全波長酶標儀(型號 RT-6000):深圳雷杜公司;高速冷凍離心機(型號 JW3021HR):安徽嘉文儀器公司;渦旋混合器(型號 GL-88B):其林貝爾儀器制造公司;TS-12生物組織自動脫水機;BM-IX生物組織石蠟包埋機;LEICA 2016輪轉式切片機;Olympus BX51顯微鏡;JD-80ID形態(tài)學圖形分析系統(tǒng)。
2.1 模型復制 基礎致敏階段采用腹腔注射、局部刺激階段采用滴鼻的方法復制AR豚鼠模型[11]。①基礎致敏階段:OVA和氫氧化鋁以1∶100容積比溶于生理鹽水中,使OVA的濃度為0.3%,作為致敏劑。每只豚鼠腹腔注射1 mL,隔日1次,共致敏7次,用時14 d。②局部刺激階段:從第22—31天,對每只豚鼠采用滴鼻法,以5% OVA生理鹽水溶液每側5 μL滴于豚鼠雙側鼻孔,隔日1次。以上步驟正常組均以等容積生理鹽水代替。
每日滴鼻后,依據(jù)鼻癢、流涕、呼吸輕重程度及噴嚏次數(shù)多少為評分標準[12]。①鼻癢:輕擦鼻幾次,計1分;撓鼻不止,計2分;不斷撓鼻,計3分。②流涕:流至前孔,計1分;過鼻孔,計2分;流涕滿面,計3分。③呼吸:呼吸急促,計1分;明顯喘息,計2分;喘息致死,計3分。④噴嚏:滴鼻后30 min內(nèi)1~3個,計1分;4~10個,計2分;10個以上,計3分。于第22、26、30天滴鼻后30 min內(nèi),觀察各組豚鼠的過敏性癥狀,并將各癥狀積分疊加,總分大于5分者為模型復制成功。
2.2 分組及給藥 最后一次滴鼻后,根據(jù)鼻部行為學癥狀評分結果重新隨機分為7組。正常組與模型組豚鼠灌胃給予等容量蒸餾水,其余各組豚鼠分別灌胃給予相應藥物,連續(xù)14 d,每日1次。同時采用5% OVA生理鹽水溶液隔日滴鼻,以維持過敏性癥狀直至實驗結束。并于給藥后第7、13天滴鼻后30 min觀察過敏性癥狀并進行評分。
2.3 檢測指標及方法
2.3.1 鼻部行為學癥狀觀察 模型復制期間,于局部刺激階段觀察第22、26、30天各組豚鼠的過敏性癥狀并進行評分。給藥期間,于給藥第7、13天再次激發(fā),觀察各組豚鼠的過敏性癥狀并記錄最后一次滴鼻評分。評分標準見“2.1項”。
2.3.2 鼻黏膜組織病理變化觀察 末次給藥1 h后,用10%水合氯醛麻醉處死豚鼠,打開鼻蓋骨,暴露鼻甲及骨性鼻中隔,剝離完整鼻黏膜后放入4%甲醛固定,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,光學顯微鏡下觀察、拍照、分析。
2.3.3 血清IL-4、IFN-γ及IgE水平檢測 末次給藥1 h后,用10%水合氯醛麻醉處死。腹主動脈取血,推入離心管靜置3 h后,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,收集血清。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書操作,依次檢測實驗豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、IgE水平。
3.1 蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻部行為學癥狀的影響 模型復制期間,從第1次滴鼻開始,豚鼠30 min內(nèi)均出現(xiàn)不同程度撓鼻、噴嚏癥狀,但無明顯流涕、呼吸急促等癥狀;從第3次滴鼻開始,復制模型的豚鼠不僅出現(xiàn)撓鼻不止、噴嚏不斷,還出現(xiàn)流涕、呼吸急促等癥狀;隨著滴鼻次數(shù)的增加,模型豚鼠過敏性癥狀也越來越明顯。結果說明采用OVA和氫氧化鋁腹腔注射并局部刺激的豚鼠AR模型復制成功。
給藥后,與模型組相比,除玉屏風散組外,其他用藥組AR豚鼠鼻部行為學癥狀積分均有不同程度的降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果說明蒼耳子水提取物對AR豚鼠的過敏性癥狀有一定影響。見表1。
3.2 各組豚鼠鼻黏膜組織形態(tài)學變化比較 HE染色結果顯示,正常組豚鼠鼻黏膜上皮組織結構完整,無血管、腺體改變及炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤(圖1A)。模型組豚鼠鼻黏膜上皮組織出現(xiàn)明顯脫落,小血管、腺體出現(xiàn)明顯的增生擴張,組織水腫,大量炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤(圖1B);氯雷他定組鼻黏膜上皮組織結構較為完整,未見明顯小血管增生,少量炎癥細胞浸潤(圖1C);玉屏風散組鼻黏膜上皮組織輕微脫落,腺體輕微擴張,有嗜酸性粒細胞浸潤(圖1D);蒼耳子水提取物高劑量組鼻黏膜上皮組織較為完整,少量炎癥細胞浸潤(圖1E);中劑量組上皮組織基本完整,組織輕微水腫,有炎癥細胞浸潤(圖1F);低劑量組鼻黏膜上皮組織有輕微脫落,小血管、腺體增生擴張明顯,炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤明顯(圖1G)。
表1 各組豚鼠鼻部行為學癥狀積分比較
注:與正常組比較,*P<0.05
注:A.正常組;B模型組;C.氯雷他定組;D.玉屏風散組;E.蒼耳子水提取物高劑量組;F.蒼耳子水提取物中劑量組;G.蒼耳子水提取物低劑量組圖1 各組豚鼠鼻黏膜組織形態(tài)學變化比較(HE染色,10×20倍)
3.3 各組豚鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較 與正常組比較,模型組豚鼠血清IgE、IL-4水平顯著升高(P<0.05),IFN-γ水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,各用藥組豚鼠血清IgE、IL-4水平顯著降低(P<0.05),IFN-γ水平顯著升高(P<0.05);蒼耳子水提取物各劑量組IgE、IL-4、IFN-γ水平多重比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見表2。
蒼耳子作為臨床治療鼻淵頭痛的常用藥,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用。在調(diào)節(jié)免疫功能方面,蒼耳子水煎液中琥珀酸被認為可能是蒼耳子調(diào)節(jié)免疫功能的活性成分之一[13]。王龍妹等[14]發(fā)現(xiàn),蒼耳子水煎液對細胞免疫作用明顯。張芩等[15]發(fā)現(xiàn),玉屏風散合蒼耳子散可調(diào)節(jié)機體免疫功能。
豚鼠具有易致敏的生物學特性,并且因血清中含有大量的補體,能產(chǎn)生穩(wěn)定的、高效價的特異性免疫球蛋白,常被選為AR的模型動物。因此,以OVA和氫氧化鋁的混懸液作為致敏劑,腹腔注射和滴鼻激發(fā)AR豚鼠模型。陣發(fā)性噴嚏、鼻癢、流涕等為AR患者的典型癥狀,滴鼻激發(fā)可使模型動物產(chǎn)生相同的過敏性癥狀,對過敏性癥狀進行評分可以初步判斷模型是否成功,是評價藥物治療AR療效的主要方法[11-12]。
Th1細胞主要介導細胞免疫應答,通過釋放IFN-γ、IL-2等細胞因子來抑制Th2細胞活化;Th2細胞主要介導體液免疫應答,通過產(chǎn)生IL-4、IL-5等細胞因子來抑制Th1細胞分化,當Th1細胞釋放的IFN-γ等細胞因子不足時,Th2細胞出現(xiàn)亢進現(xiàn)象,產(chǎn)生大量的IL-4,從而引起IgE過量[16-17]。因此,通過檢測豚鼠血清中IL-4和IFN-γ水平變化,可以評價蒼耳子水提取物對Th1/Th2細胞平衡的影響,同時檢測血清中IgE水平變化,可以反映AR豚鼠病理狀態(tài)的嚴重程度。
除IL-4外,Th2細胞還可以釋放其他細胞因子刺激肥大細胞釋放遞質(zhì),從而引起鼻黏膜上皮組織病變,鼻黏膜上皮組織由柱狀纖毛細胞、柱狀細胞、杯狀細胞和基底細胞緊密相連于基底膜上形成上皮屏障。當接觸變應原后,會出現(xiàn)基底膜病變,致使柱狀細胞脫落、炎癥細胞浸潤、小血管擴張等病變[18]。因此,通過HE染色觀察AR豚鼠鼻黏膜病理變化以評價蒼耳子水提取物對AR豚鼠鼻黏膜組織的影響。
表2 各組豚鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較
注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與氯雷他定組比較,△P<0.05;與玉屏風散組比較,◇P<0.05;與蒼耳子水提取物高劑量組比較,□P<0.05;與蒼耳子水提取物中劑量組比較,▲P<0.05
本研究結果表明,蒼耳子水提取物可以改善AR豚鼠的過敏性癥狀,減輕AR豚鼠鼻黏膜的病理改變,降低血清中IL-4水平,升高IFN-γ的水平,從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡,降低血清IgE水平,進而發(fā)揮其治療AR的作用。