洪星輝，王 靚，方海雁，黃金玲

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，安徽 合肥 230012)

胃癌是一種侵襲性較強(qiáng)的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均居于惡性腫瘤的前列[1]。據(jù)報(bào)道，中國每年新增病例大約占全球的40%[2]。盡管近年來對(duì)早期胃癌的診斷技術(shù)不斷進(jìn)步，外科微創(chuàng)技術(shù)和化學(xué)治療等多種治療手段也已廣泛運(yùn)用于胃癌的治療,但是進(jìn)展期胃癌的預(yù)后差和5年存活率低的問題仍然沒有得到有效的解決。因此，如何有效抑制進(jìn)展期胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移不僅是目前科研探索的方向，更是提高臨床療效和改善患者術(shù)后生存率的關(guān)鍵性問題。

重樓總皂苷(Rhizoma Paridis total saponin，RPTS)是從中藥重樓中提取出來的一種皂苷類成分?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載重樓具有清熱解毒、消腫止痛的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明RPTS具有較好的抗腫瘤活性，對(duì)胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用[3-6]。但是RPTS抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用及其機(jī)制還少有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察RPTS對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中科院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑 重樓為中藥飲片，采購自安徽濟(jì)仁藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地為云南，批號(hào)111012，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥與資源教研室俞年軍教授鑒定，確認(rèn)為云南重樓ParispolyphyllaSmithvar.yannanensis(Franch)Hand.-Mazz。按照參考文獻(xiàn)[7-10]方法提取制備得干浸膏。高氯酸比色法[11]測定重樓醇提物中PRTS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.6%。四甲基偶氮唑藍(lán)( methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HyClone公司；Transwell小室(直徑8 μm)購自美國Millipore公司。

1.3 主要儀器 Forma 370細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；Centrifuge 5430R超低速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；SPEC-TRAMax M2e酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；BX51倒置顯微鏡：日本Olympus公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中,37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化，用DMEM高糖完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5.0×104/mL，將細(xì)胞懸液以每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于各孔中加入終濃度分別為0、2.5、5、10、20、40 μg/mL RPTS，每組6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，到達(dá)時(shí)間作用點(diǎn)后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL、37 ℃孵育4 h，棄上清后加入150 μL DMSO,平板搖床震搖10 min，用酶標(biāo)儀測量各孔在490 nm波長處的吸光度(absorbance, A)，用光密度(optical density, OD)值表示A的大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞活力(cell viability ratio,RCV)。RCV的計(jì)算公式：

RCV=(A實(shí)驗(yàn)―A空白)/(A對(duì)照―A空白) 100%。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移率 取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至7×105/mL，接種于6孔板當(dāng)中。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁，用10 μL槍頭在孔板底部中央均勻劃出一條橫線，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline， PBS)清洗后，在各孔中分別加入終濃度為0、2.5、5、10 μg/mL的RPTS，用無血清高糖DMEM培養(yǎng)，0、24 h光學(xué)顯微鏡下拍照(10×20倍)，觀察細(xì)胞遷移情況。通過軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕寬度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算細(xì)胞24 h 遷移率(migration ratio,Rm)。Rm的計(jì)算公式：

Rm=(l0 h-l24 h)/l0 h。

式中l(wèi)0 h、l24 h分別表示0、24 h劃痕寬度。

2.4 Matrigel transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將BD膠和預(yù)冷的無血清DMEM培養(yǎng)液按1∶3比例稀釋混勻，取100 μL均勻地鋪在帶有8 μm孔徑聚碳酸酯膜的Transwell小室內(nèi)，并放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置1 h，使BD膠凝固。將Matrigel transwell小室至于24孔板中，同時(shí)下室加入含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液。調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106/mL，Transwell上室內(nèi)加入細(xì)胞懸液100 μL。在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h待其貼壁后，加入不同濃度RPTS(0、2.5、5、10 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。取出Matrigel transwell小室，用棉簽小心擦去小室上層未遷移細(xì)胞，并用PBS清洗3次后，用0.1%結(jié)晶紫在室溫染色20 min。用PBS清洗3次。每組隨機(jī)選取5個(gè)不同高倍視野(10×20倍)計(jì)細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 RPTS對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RPTS(10、20、40 μg/mL)處理SGC-7901細(xì)胞24 h之后，有明顯抑制作用(P<0.05)，隨著濃度的升高，細(xì)胞的增殖率逐漸減少。但RPTS(2.5、5 μg/mL)組與空白對(duì)照組相比，OD值差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明RPTS(2.5、5 μg/mL)對(duì)細(xì)胞增殖沒有明顯抑制作用，結(jié)果見圖1。因此為盡量減少RPTS對(duì)細(xì)胞毒性作用的影響，篩選RPTS(2.5、5、10 μg/mL)作為后續(xù)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 RPTS對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2.5、5、10 μg/mL濃度RPTS給藥組處理細(xì)胞24 h后，劃痕距離明顯大于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而且RPTS的遷移抑制作用呈濃度依賴關(guān)系，結(jié)果見圖2、圖3。

3.3 RPTS對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲能力的影響 Matrigel transwell小室下室細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色，在Olympus BX51倒置熒光下觀察，可以看出2.5～10 μg/mL濃度RPTS給藥組，下室侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著RTPS濃度的增加，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見圖4、圖5。

注：與0 μg/mL RPTS組比較，*P<0.05

注：與0 μg/mL RPTS組比較，*P<0.05

4 討論

腫瘤可以侵襲和轉(zhuǎn)移到相距很遠(yuǎn)的組織和器官當(dāng)中。對(duì)于還沒有形成遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的腫瘤而言，其治愈率可以達(dá)到90%[12]。然而當(dāng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至其他組織，現(xiàn)代醫(yī)療水平很難達(dá)到理想的治療效果。

在臨床上，腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段的綜合過程，一般要經(jīng)過腫瘤管道的生成、形態(tài)改變、運(yùn)動(dòng)能力的增加、分泌蛋白酶、降解基底膜、在管道中運(yùn)輸、繼發(fā)器官的生長等步驟[13]。而胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移更是涉及血管、淋巴轉(zhuǎn)移、腹腔的種植性轉(zhuǎn)移，以及肝臟的轉(zhuǎn)移，這些不可預(yù)期的轉(zhuǎn)移途徑是導(dǎo)致患者術(shù)后復(fù)發(fā)和大多數(shù)胃癌患者死亡的主要原因。現(xiàn)代腫瘤學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，胃癌細(xì)胞黏膜下層的浸潤深度以及轉(zhuǎn)移的過程十分復(fù)雜,不僅與腫瘤的病理分型和組織分化程度緊密相關(guān)，而且還涉及到多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和多層次的交叉調(diào)控。

注：A. RPTS 0 μg/mL組；B. RPTS 2.5 μg/mL組；C. RPTS 5 μg/mL組；D. RPTS 10 μg/mL組

圖4倒置熒光顯微鏡下觀察RPTS對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901體外侵襲能力的影響(10×20倍)

本實(shí)驗(yàn)在前期研究RPTS抗人胃癌細(xì)胞增殖活性基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了RPTS對(duì)人胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，RPTS 10、20、40 g/mL劑量組具有較好的體外抗人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的活性。為盡量減少RPTS對(duì)細(xì)胞毒性作用的影響，筆者篩選RPTS 2.5、5、10 μg/mL劑量組進(jìn)行劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RPTS表現(xiàn)出較好的抑制SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲的作用，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

綜上所述，RPTS可抑制人胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的過程，其分子學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。