申豐銘，楊三娟，張崢嶸，朱國旗

(新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038)

抑郁癥是以食欲減退、睡眠模式異常、能量水平降低、注意力或身體活動降低、低價值感和內(nèi)疚感等為特征的疾病[1]。2002年，世界衛(wèi)生組織將抑郁癥列為第四大流行疾病。除了廣泛的發(fā)病率，抑郁癥的特點還有高復(fù)發(fā)率、高殘疾率和高病死率[2]。仙茅苷是仙茅的主要活性成分。仙茅苷可通過血腦屏障，廣泛分布于大腦[3]。仙茅苷的現(xiàn)代藥理活性主要包括抗氧化活性、心血管保護、神經(jīng)保護等[4-6]。然而，尚不清楚仙茅苷是否能改善抑郁樣行為及其作用機制。因此，本研究采用學(xué)習(xí)無助小鼠模型來探討仙茅苷對其抑郁樣行為的保護作用及其機制。

1 材料

1.1 動物 雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2016-0009]。將小鼠飼養(yǎng)在溫度恒定的動物房中，光周期8:00 am—8:00 pm，自由飲水和攝食。動物進行實驗前先適應(yīng)飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與主要試劑 仙茅苷(純度98.94%)：BIOX科技有限公司；星形膠質(zhì)細胞的標(biāo)記物膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)：麻薩諸塞州沃本生物抗體公司；Alexa Fluor 593山羊抗兔IgG：加利福尼亞州卡爾斯巴德生命技術(shù)公司；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)公司；磷酸化蛋白激酶A(p-protein kinase A, p-PKA)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-extracellular regulated protein kinases，p-Erk)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases， Erk)、突觸后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)抗體：Cell Signaling Technology；3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence，ECL)：Pierce。

2 方法

2.1 動物分組、模型復(fù)制及給藥 將60只小鼠隨機分為正常對照組，學(xué)習(xí)無助組，仙茅苷高劑量(40 mg/kg)、仙茅苷中劑量(8 mg/kg)、仙茅苷低劑量(1.6 mg/kg)組，每組12只。模型復(fù)制方法參照文獻[7]。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，模型復(fù)制能夠使小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為，表現(xiàn)為小鼠在懸尾和強迫游泳實驗中不動時間的增加。在第1—14天，仙茅苷治療組每日以40、8、1.6 mg/kg的劑量腹腔注射，仙茅苷溶于生理鹽水(含0.1% DMSO)，正常對照組和學(xué)習(xí)無助組小鼠不進行給藥。在第8—10天，學(xué)習(xí)無助組和仙茅苷給藥組進行復(fù)制模型，連續(xù)3 d在同一時間內(nèi)給予學(xué)習(xí)無助組和仙茅苷高、中、低劑量組小鼠不可避免的足底電擊(0.70 mA，每次電擊20 s，間隔隨機)30次，這一過程是在條件恐懼箱中用ANY-Maze軟件(Stoelting Co. verion 4.99 m)控制進行的。正常對照組小鼠在第8—10天，置于相同的環(huán)境中，但不給予足底電擊。24 h進行行為學(xué)實驗，經(jīng)異氟烷麻醉后斷頭取腦組織，檢測海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)細胞凋亡、GFAP表達及相關(guān)信號通路的表達變化。

2.2 懸尾實驗(tail suspension test，TST) 仙茅苷治療14 d后，用膠帶將每只小鼠(距離尾部約1 cm處)懸掛在隔音箱頂部(距底部約50 cm)。各組懸尾6 min，前2 min為適應(yīng)時間，記錄第3—6分鐘內(nèi)小鼠不動時間的總和。實驗結(jié)束后，迅速將小鼠從支架取下并輕放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。

2.3 強迫游泳實驗(forced swim test，F(xiàn)ST) 將小鼠分別置于水面高10 cm的2 L玻璃容器中，水溫為(22±3)℃，游泳6 min，結(jié)束后將小鼠烘干(32 ℃)后放入籠中。用Super Maze軟件記錄行為。將測試的最后4 min不動時間納入統(tǒng)計。

2.4 免疫熒光檢測海馬DG區(qū)GFAP熒光強度 小鼠用異氟烷麻醉后處死取腦。小鼠腦組織在4%多聚甲醛中固定24 h，用30%蔗糖4 ℃脫水，冰凍切片(片厚20 μm)，封閉(10%山羊血清)1 h。加入0.1 mol/L PBS(含有0.4%Triton X-100和5%山羊血清)稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，每次15 min。洗完再加入Alexa Fluor 593山羊抗兔IgG，室溫下孵育2 h。之后再用PBS洗滌3次，胞核經(jīng)4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) 染色，貼片，樹脂封片。使用激光共聚焦顯微鏡拍攝圖像。使用Image J軟件將DAPI和GFAP合并得到Merge，并分析GFAP的熒光強度值。

2.5 TUNEL染色檢測海馬DG區(qū)細胞凋亡數(shù) 步驟按照一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行，在20 μm腦切片中進行TUNEL染色。染色后，使用激光共聚焦顯微鏡對切片成像。使用Image J 軟件中的“自由手選擇”功能繪制每個圖像中海馬體的輪廓對海馬體進行分析，使用Image J 中的“粒子分析”功能對海馬DG區(qū)TUNEL染色陽性細胞進行計數(shù)。

2.6 Western blot檢測海馬區(qū)相關(guān)蛋白的表達水平 將從每組小鼠腦中提取得到的海馬組織加入RIPA(含PMSF)勻漿裂解，用于檢測PKA、Erk磷酸化水平及PSD95的表達。用SDS-PAGE在120 V下電泳分離蛋白質(zhì)樣品，時間50 min，并在200 mA下轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrance，NC)膜上。用5%脫脂奶粉封閉NC膜，室溫下2 h，然后與用一抗稀釋液以1∶1 000稀釋的p-PKA、PKA、p-Erk、Erk、PSD95抗體以及內(nèi)參GAPDH置于搖床中，4 ℃下孵育過夜，PBST洗滌3次，之后加入二抗(1∶10 000稀釋)孵育2 h，洗滌。ECL顯色，曝光。使用Image J軟件分析條帶的光密度值?？偟鞍椎南鄬坑闷渑cGAPDH的比值表示。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠學(xué)習(xí)無助引發(fā)的抑郁樣行為比較 小鼠的抑郁樣行為可用TST、FST來評估。在TST中，與正常對照組比較，學(xué)習(xí)無助組小鼠不動時間顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與學(xué)習(xí)無助組比較，仙茅苷給藥組小鼠不動時間顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1-Ⅰ。在FST中，與正常對照組比較，學(xué)習(xí)無助組小鼠不動時間顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與學(xué)習(xí)無助組比較，仙茅苷給藥組小鼠不動時間顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1-Ⅱ。

注：Ⅰ.TST中小鼠不動時間；Ⅱ.FST中小鼠不動時間；A.正常對照組；B.學(xué)習(xí)無助組；C.仙茅苷高劑量組；D. 仙茅苷中劑量組；E. 仙茅苷低劑量組；與正常對照組比較，*P<0.05；與學(xué)習(xí)無助組比較，#P<0.05

圖1各組小鼠學(xué)習(xí)無助引發(fā)的抑郁樣行為比較

3.2 各組小鼠海馬組織DG區(qū)細胞凋亡數(shù)比較 與正常對照組比較，學(xué)習(xí)無助組海馬組織DG區(qū)細胞凋亡數(shù)顯著增加(P<0.05)；與學(xué)習(xí)無助組比較，仙茅苷高劑量組海馬組織DG區(qū)細胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.05)。見圖2、圖3。

注：A.正常對照組；B.學(xué)習(xí)無助組；C.仙茅苷高劑量組；箭頭示凋亡細胞

圖2各組小鼠海馬組織DG區(qū)細胞凋亡免疫熒光圖(TUNEL染色，10×20倍)

注：A.正常對照組；B.學(xué)習(xí)無助組；C.仙茅苷高劑量組；與正常對照組比較，*P<0.05；與學(xué)習(xí)無助組比較，#P<0.05

3.3 各組小鼠海馬DG區(qū)GFAP表達比較 與正常對照組比較，學(xué)習(xí)無助組小鼠海馬DG區(qū)GFAP表達顯著上調(diào)(P<0.05)；與學(xué)習(xí)無助組比較，仙茅苷高劑量組海馬組織DG區(qū)GFAP表達顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖4、圖5。

3.4 各組小鼠海馬組織中p-PKA、p-Erk、PSD95表達比較 與正常對照組比較，學(xué)習(xí)無助組小鼠海馬組織中p-PKA、PSD95表達顯著下調(diào)(P<0.05)，p-Erk表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與學(xué)習(xí)無助組比較，仙茅苷高劑量組小鼠海馬組織中p-PKA、PSD95表達顯著上調(diào)(P<0.05)，p-Erk表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

4 討論

學(xué)習(xí)無助模型是最早用于復(fù)制抑郁癥的模型之一[8]，其屬于抑郁癥的環(huán)境應(yīng)激模型。學(xué)習(xí)無助模型可以反映與抑郁癥相關(guān)的重要認知變化。有充足

圖4 各組小鼠海馬DG區(qū)GFAP表達免疫熒光圖(免疫熒光染色，10×20倍；箭頭指示活化的星形膠質(zhì)細胞)

注：A.正常對照組；B.學(xué)習(xí)無助組；C.仙茅苷高劑量組；與正常對照組比較，*P<0.05；與學(xué)習(xí)無助組比較，#P<0.05

的證據(jù)表明，學(xué)習(xí)無助動物表現(xiàn)出與人類抑郁相似的幾種行為變化[9]。研究表明，仙茅苷可以改善和治療圍絕經(jīng)期小鼠模型的抑郁癥狀[10]。在本研究中，筆者選用了學(xué)習(xí)無助小鼠模型，結(jié)果表明學(xué)習(xí)無助引起的抑郁樣行為通過TST和FST得到驗證，而仙茅苷治療能改善其抑郁樣行為。在仙茅苷給藥組中，仙茅苷高劑量(40 mg/kg)組的抑郁樣行為改善程度最為顯著。因此，在后續(xù)的指標(biāo)檢測中選取仙茅苷高劑量組進行機制的研究。

細胞凋亡是細胞死亡的一種形式，過度或不適當(dāng)?shù)募毎蛲雠c許多疾病有關(guān)，其中就包括抑郁癥[11]。研究表明，持續(xù)的壓力可以導(dǎo)致海馬的興奮性神經(jīng)毒性損傷，并影響其功能[12]。許多抗抑郁藥的作用可能是通過抑制神經(jīng)細胞凋亡來實現(xiàn)的[13]。本研究結(jié)果表明，學(xué)習(xí)無助小鼠海馬DG區(qū)的細胞凋亡顯著增加，而給予仙茅苷能夠明顯抑制這一變化。此結(jié)果也提示仙茅苷可以通過抑制細胞凋亡來發(fā)揮抗抑郁的作用。

神經(jīng)細胞死亡與星形膠質(zhì)細胞功能密切相關(guān)。星型膠質(zhì)細胞激活可能是抑郁樣行為發(fā)生的重要機制。星形膠質(zhì)細胞可以通過數(shù)量增加或體積增大來引起神經(jīng)細胞損傷并表達更高水平的GFAP[14]。星形膠質(zhì)細胞激活可以破壞神經(jīng)細胞突觸傳遞并發(fā)生在各種神經(jīng)退行性疾病中[15]。本研究結(jié)果表明，學(xué)習(xí)無助小鼠中GFAP陽性表達增加，而通過給予仙茅苷處理抑制了這種表達。

PKA參與代謝、細胞生長、基因表達和細胞凋亡。在抑郁模型中，PKA在海馬中的表達和活性降低，而抗抑郁藥可以增加皮質(zhì)和海馬中的PKA活性，如三環(huán)類抗抑郁藥和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑聯(lián)用可增加皮質(zhì)和海馬中p-PKA水平，而且應(yīng)激和抑郁中突觸可塑性的變化可能與PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)[16]。本研究結(jié)果表明，學(xué)習(xí)無助組中PKA磷酸化水平降低，而給予仙茅苷處理可以逆轉(zhuǎn)p-PKA降低，而且學(xué)習(xí)無助組中PSD95水平降低，而給予仙茅苷治療可以使學(xué)習(xí)無助引起的PSD95表達降低恢復(fù)正常。PKA信號通路可能與抑郁中的突觸可塑性變化有關(guān)，仙茅苷作用的具體機制需要進一步的研究。

注：Ⅰ.代表性蛋白印跡條帶；Ⅱ.p-PKA表達結(jié)果；Ⅲ.p-Erk表達結(jié)果；Ⅳ.PSD95表達結(jié)果；A.正常對照組；B.學(xué)習(xí)無助組；C.仙茅苷高劑量組；與正常對照組比較，*P<0.05；與學(xué)習(xí)無助組比較，#P<0.05

圖6各組小鼠海馬組織中p-PKA、p-Erk、PSD95表達比較

本研究證實仙茅苷可以改善模型小鼠抑郁樣行為，抑制學(xué)習(xí)無助小鼠的神經(jīng)細胞凋亡，并使學(xué)習(xí)無助小鼠星形膠質(zhì)細胞的活化減少。這些數(shù)據(jù)表明仙茅苷可能是一種有效的抗抑郁藥。仙茅是治療抑郁的處方“二仙湯”的主要成分之一，而仙茅苷是仙茅的主要活性成分。因此，仙茅及以仙茅為君藥的二仙湯的抗抑郁作用很可能是通過仙茅苷來發(fā)揮作用的。