張晟銘，于慶生，彭 輝，劉舉達，周富海，經(jīng)文善，余樹山，馮 輝

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院普外科，安徽 合肥 230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)外科研究所，安徽 合肥 230031)

腸道是機體進行食物消化與各類營養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要場所，同時也是機體各種細菌與毒素富集之地，人體內(nèi)雖有各種屏障保護，但腸上皮黏膜機械屏障是機體抵抗腸道病原微生物入侵的首要屏障，因為其可有效通過其內(nèi)緊密連接阻斷大分子物質(zhì)及各種微生物。研究發(fā)現(xiàn)，緊密連接主要由緊密連接蛋白(zonula occludin-1，ZO-1)、封閉蛋白、咬合蛋白構(gòu)成[1-2]。

目前，通過多種方法干預(yù)腸黏膜上皮緊密連接及其分子結(jié)構(gòu)的研究在國內(nèi)外已有報道[3-4]，中醫(yī)藥對其影響的研究較少[5-6]，而有關(guān)健脾通里中藥對手術(shù)創(chuàng)傷后腸黏膜上皮緊密連接及其分子干預(yù)的研究更是空白。既往研究證實，健脾通里中藥芪黃煎劑在保護腸黏膜屏障功能上有顯著療效[7]，但其對緊密連接的作用尚未可知。

本研究擬觀察芪黃煎劑對胃切除模型大鼠腸黏膜上皮緊密連接形態(tài)、寬度的影響，并觀察其對小腸組織ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達的影響，以探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 45只健康清潔級Wistar雄性大鼠，日齡(56±7)d，體質(zhì)量(298±22)g。由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2017-001]提供。在恒溫(24±2)℃、光照12 h環(huán)境、相對濕度控制在45%～55%，自由飲水進食。

1.2 藥物及配制 按照筆者既往研究方法[8]，將中藥黃芪、大黃、白術(shù)、黨參、枳實、厚樸、丹參、黃芩按20∶10∶20∶20∶10∶10∶15∶12質(zhì)量比混合，量取按此比例混合的生藥234 g，加水500 mL，煎30 min(其中大黃后下)，過濾濃縮至1.0 g/mL的生藥煎劑，4 ℃保存。中藥及整蛋白型腸內(nèi)營養(yǎng)劑(德國milupa gub H生產(chǎn)，批準文號 H20030467)均購于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房。

1.3 試劑及儀器 Trizol試劑購自美國Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master購自美國Roche公司，引物由上海生物工程股份有限公司合成；透射電鏡(JEM-1010)購于日本日立公司；RT-PAR儀(StepOne型)購于美國Agilent公司；逆轉(zhuǎn)錄儀購于德國Eppendorf公司。

2 方法

2.1 動物分組及胃切除模型制作 實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、標準腸內(nèi)營養(yǎng)組、中藥組，每組15只。采用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉所有大鼠，用75%乙醇無菌操作手術(shù)區(qū)，選擇腹部中腹切口，逐層進入腹腔，找到大鼠的胃，切斷胃的大小彎曲之間的胃前壁，用1-0絲線“8”字縫合。縫合后，在大鼠十二指腸懸韌帶(Treitz韌帶)遠端15 cm的空腸前壁處，用12號注射器針頭打孔，并將1.0 mm直徑的硅導(dǎo)膠管置于空腸中。在腹壁上戳出另一個小孔，由導(dǎo)管的另一端將導(dǎo)管從頸背的雙側(cè)肩胛區(qū)域的皮膚取出，并且縫合腹部和頸部后切口。假手術(shù)組：隨機選擇15只清潔型大鼠，僅縫合中腹部切口，未進行胃切除術(shù)。

2.2 干預(yù)方法 ①假手術(shù)組：手術(shù)后僅自由飲水進食。②標準腸內(nèi)營養(yǎng)組：術(shù)后第1天起，進行腸內(nèi)營養(yǎng)，滴注方法、熱量參照文獻[8]方法，腸內(nèi)營養(yǎng)制劑選用瑞素160 g用溫開水溶解成500 mL的溶液，每100 mL含830 kJ熱量，每只大鼠按每日120 kJ/kg提供熱量，每日注入腸內(nèi)營養(yǎng)液容積的計算公式：

V(營養(yǎng)液)=(120 kJ/kg×m(體質(zhì)量)/(8.3 kJ/mL)。

式中體質(zhì)量的計量單位為kg。每小時滴入營養(yǎng)液2 mL，分2次注入，持續(xù)1周。③中藥組：滴注的營養(yǎng)制劑、熱量、方法、療程均同標準腸內(nèi)營養(yǎng)組。按照文獻[8]的方法，在滴注營養(yǎng)液前給予芪黃煎劑，每小時滴入營養(yǎng)液2 mL，每日2次，溫度保持25 ℃。持續(xù)1周。

2.3 標本制作和指標檢測方法

2.3.1 緊密連接結(jié)構(gòu)檢測 所有大鼠干預(yù)7 d后，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后取材，2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定，90%乙醇混合90%丙酮(1∶1)脫水，純丙酮+OTC包埋液(1∶2)室溫過夜包埋，45 ℃烘箱內(nèi)烘烤12 h固化，超薄切片機對組織塊切片為50～60 nm，鈾鉛染液染色，透射電鏡下觀察腸黏膜上皮細胞緊密連接的超微結(jié)構(gòu)并攝片保存，使用螺旋測微器測量照片中緊密連接寬度，對照放大倍數(shù)計算得出緊密連接寬度。

2.3.2 熒光定量PCR檢測ZO-1 取100 mg小腸組織，液氮中研成粉末，收集入2 mL Eppendorf管中，加入1 mL Trizol，按照說明書操作提取總RNA，在One drop超微量分光光度計上檢測260 nm和280 nm吸光度，分析RNA的純度和含量。使用MMLV Reverse Transcriptase試劑盒(大連寶生物公司)將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Kit (Takara Bio Inc.)進行qPCR檢測，PCR反應(yīng)在ABI StepOne Plus系統(tǒng)上進行，95 ℃下預(yù)變性10 min；95 ℃下反應(yīng)20 s，60 ℃下反應(yīng)30 s，72 ℃下反應(yīng)30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。擴增使用的引物：

封閉蛋白：正向引物為5′-CCTGCCCCAATGGAAGATTT-3′，反向引物為5′-CCGATGACAGCCATCCACAT-3′；

咬合蛋白：正向引物為5′-TGCATGTTCGACCAATGC-3，反身引物為 5′-AAGCCACTTCCTCCATAAGG-3′；

ZO-1：正向引物為5′-CGCCTCTGTCCAACTCTTCTCT-3′，反向引物為5′-GTGTGAATCGGTTGTATGCTG-3′；

GAPDH：正向引物為5′- GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′，反向引物為5′- AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3′。

3 結(jié)果

3.1 3組大鼠腸黏膜上皮細胞緊密連接形態(tài)及寬度比較 透射電鏡下，3組大鼠腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)(箭頭所示)均清晰可見，緊密連接位于上皮細胞側(cè)面、近游離面的頂端，呈狹窄的帶狀(焊接線或嵴線)；緊密連接處可見細胞膜表面不連續(xù)的融合點或吻合點。見圖1。與假手術(shù)組比較，標準腸內(nèi)營養(yǎng)組大鼠腸黏膜上皮細胞緊密連接寬度顯著減小(P<0.05)；與標準腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，中藥組大鼠腸黏膜上皮細胞緊密連接寬度顯著增加(P<0.05)。見表1。

3.2 3組大鼠小腸組織中ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達水平比較 與假手術(shù)組比較，標準腸內(nèi)營養(yǎng)組大鼠小腸組織中ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達水平均顯著下調(diào)(P<0.05)；與標準腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，中藥組ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表2。

注:A.假手術(shù)組;B.標準腸內(nèi)營養(yǎng)組;C.中藥組圖1 3組大鼠腸黏膜上皮細胞緊密連接的形態(tài)(鈾鉛染液染色,1×20 000倍)

表1 3組大鼠緊密連接寬度比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與標準腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，#P<0.05

表2 3組大鼠小腸組織緊密連接相關(guān)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與標準腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，#P<0.05

4 討論

腸上皮作為腸腔與腸間質(zhì)之間的界面，不僅調(diào)控機體水液以及各組營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，還為抵抗各類病原體及抗原提供了第一道屏障，這一作用的實現(xiàn)有賴于腸上皮細胞間的重要結(jié)構(gòu)——緊密連接[9-10]。緊密連接結(jié)構(gòu)主要由兩種ZO-1組成，一種是細胞膜上存在的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白；另一種是位于細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，其與細胞的各種蛋白質(zhì)結(jié)合，并且具有膜蛋白和細胞骨架橋梁的作用。它們呈帶狀廣泛分布于細胞中，前者主要由跨膜蛋白咬合蛋白與封閉蛋白構(gòu)成，后者主要由胞內(nèi)支架蛋白ZO蛋白家族組成[11]。它們連同細胞骨架一起，是緊密連接黏膜屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，決定了腸道的選擇透過性[12]。

封閉蛋白是一種分子量約20 000的緊密連接跨膜蛋白，兩個細胞外環(huán)和一個短細胞內(nèi)環(huán)由211個氨基酸殘基組成，相鄰細胞通過外環(huán)由“拉鏈”結(jié)構(gòu)封閉，封閉蛋白的C-末端能與ZO-1相互作用來促進緊密連接的合成，促進傷口愈合[13]。咬合蛋白是一種分子量約為65 000的跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)與封閉蛋白類似，差異在于其N-末端與C-末端顯著縮短。有研究結(jié)果表明，咬合蛋白可能參與協(xié)調(diào)細胞骨架的活動與各種信號通路，以維護上皮細胞表型，促進創(chuàng)傷的愈合[14-15]。ZO-1是一種分子量為2.2×105的支架蛋白，由1 475個氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn)，ZO-1可以感受到胞外對緊密連接的機械沖擊，進而協(xié)調(diào)細胞增殖分化，極化細胞，裝配連接細胞的過程，從而促進創(chuàng)傷的愈合[16]。本實驗結(jié)果表明，胃切除大鼠腸黏膜緊密連接連續(xù)性和完整性遭到破壞，緊密連接寬度明顯變窄；運用健脾通里中藥芪黃煎劑后，大鼠腸黏膜上皮受損的緊密連接得到修復(fù)。從分子生物學角度來分析，本實驗中胃切除大鼠模型的建立使ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA表達水平降低，提示創(chuàng)傷能夠使腸黏膜受到損傷；運用芪黃煎劑后，腸上皮內(nèi)ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白mRNA水平顯著增加，說明中藥芪黃煎劑能夠修復(fù)受損的腸黏膜細胞。其作用機制可能是提升了腸黏膜上皮細胞ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白水平，加速腸黏膜中ZO-1的恢復(fù)，加速腸黏膜屏障的恢復(fù)，促進機體的恢復(fù)。

筆者根據(jù)長期的臨床實踐[17-19]觀察到，胃癌術(shù)后患者早期常出現(xiàn)氣短、乏力、舌淡、苔白、脈細弱，或是腹部脹痛、肛門未排氣排便的癥狀，屬于氣血虛弱與腑實氣滯并存的證候。依據(jù)李東垣《脾胃論》中補中益氣湯和張仲景《傷寒論》中大承氣湯的組方的啟示，取補中益氣湯中黃芪、白術(shù)和黨參以補其虛，取大承氣湯中大黃(后下)、枳實和厚樸以泄其實，再配伍黃芩、丹參并命名“芪黃煎劑”。方中大黃通里攻下、蕩滌腸胃，枳實行氣散結(jié)、消痞除滿，厚樸行氣消積、通腑行氣，此三藥配伍取大承氣湯之功用以推陳出新，促進胃切除術(shù)后胃腸之腑蠕動、傳化功能恢復(fù)。黃芪健脾補中、益氣養(yǎng)血，能夠加快全身各器官組織功能恢復(fù)及加快消化道功能恢復(fù)；白術(shù)補氣健脾，促進胃腸運動，抑制胃酸分泌；黨參補脾養(yǎng)胃，健運中氣，促進小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。此三藥配伍取補中益氣湯之功用以補脾益氣、行氣養(yǎng)血，促進胃切除術(shù)后氣血虧虛的恢復(fù)。再輔以黃芩清熱解毒，丹參活血化瘀，能夠改善微循環(huán)，增加吻合口周圍血流量，和具有清熱瀉下的大黃配伍能消除吻合口炎癥、水腫并促進其愈合。諸藥配伍互相協(xié)調(diào)，以達到健脾通理的功效。研究發(fā)現(xiàn)，健脾和通里中藥可以保護腸黏膜屏障[20-21]。既往的臨床及實驗研究證實芪黃煎劑具有類似的作用[7，17]。并且最近的動物實驗闡明其機制為芪黃煎劑調(diào)節(jié)ZO-1、封閉蛋白、咬合蛋白的表達，抑制ZO-1的磷酸化水平，恢復(fù)腸黏膜屏障的緊密連接連續(xù)性和完整性，從而達到保護腸黏膜屏障的作用[8]。

本實驗從腸黏膜細胞亞顯微結(jié)構(gòu)和分子水平研究健脾通里中藥芪黃煎劑能否保護腸黏膜ZO-1結(jié)構(gòu)及其可能的機制，為臨床上應(yīng)用芪黃煎劑奠定了理論基礎(chǔ)。