紀(jì)舒昱 鐘華 李雷 馮詩(shī)婷

原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)是臨床中最常見(jiàn)的青光眼類型，表現(xiàn)為眼壓升高、視神經(jīng)受壓、視盤(pán)供血不足、視功能損害等癥狀，常由小梁組織變異、靜脈壓增高等引起[1-2]。小梁網(wǎng)是房水流出的重要途徑，其功能異常使房水流出受阻，導(dǎo)致眼壓升高，是POAG發(fā)病的關(guān)鍵因素[3]。近年來(lái)研究表明，線粒體功能損傷和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致青光眼患者小梁網(wǎng)細(xì)胞損傷、凋亡及功能異常的重要原因，但其損傷的分子機(jī)制尚不完全清楚[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator factor 2 releated enzyme 1，SIRT1)是一種去乙?；?，可通過(guò)調(diào)節(jié)多種組蛋白和非組蛋白轉(zhuǎn)錄因子活性，發(fā)揮抵抗氧化應(yīng)激、延長(zhǎng)壽命等作用。研究報(bào)道，SIRT1在角膜、視網(wǎng)膜、晶狀體等眼部組織中都有表達(dá)，與角膜、白內(nèi)障等多種眼科疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)線粒體生物合成、促進(jìn)有氧代謝的轉(zhuǎn)錄共激活因子，也是SIRT1的底物[6]。SIRT1和PGC-1α在POAG小梁網(wǎng)組織功能損傷過(guò)程中的作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)POAG患者小梁網(wǎng)組織中SIRT1和PGC-1α表達(dá)水平，探討其在小梁網(wǎng)功能損傷中的可能作用，旨在為POAG臨床治療提供一定的理論參考。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2017年1月至2018年4月在海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院確診為POAG的40例(40眼)患者為研究對(duì)象，其中男23例、女17例，年齡 39～62(52.76±8.59)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)青光眼學(xué)組《我國(guó)原發(fā)性青光眼診斷和治療專家共識(shí)》中POAG相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)病理性眼壓升高，視功能障礙，前房角鏡檢查顯示房角呈開(kāi)放狀態(tài)；(3)患者知情并簽署同意書(shū)；(4)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急、慢性閉角型青光眼，青光眼睫狀體炎綜合征等繼發(fā)性開(kāi)角型青光眼；(2)虹膜睫狀體炎等其他眼部疾病引起的眼壓升高；(3)臨床病理資料缺失或有眼部手術(shù)史。

所有患者均行小梁切除術(shù)治療，術(shù)中切除的小梁網(wǎng)組織一部分立即放入液氮速凍，超低溫冰箱保存，另一部分立即置入40 g·L-1多聚甲醛中固定，保存于4 ℃冰箱。另選擇因故死亡成人供體眼球標(biāo)本30例為對(duì)照組，切除小梁組織固定保存，方法同POAG組，排除眼部疾病或其他器官、組織惡性疾病患者。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測(cè)取上述超低溫保存的POAG組和對(duì)照組小梁網(wǎng)組織，加液氮研磨，加入Trizol裂解液(美國(guó)Invitrogen公司)和氯仿(Trizol裂解液氯仿=51)，振蕩混勻15 s，37 ℃孵育2 min，4 ℃下 12 000 r·min-1離心15 min，吸取上層無(wú)色液體至干凈的無(wú)菌離心管中，加入等體積異丙醇混勻，37 ℃ 孵育10 min，4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇清洗RNA沉淀，室溫下干燥5～10 min，用無(wú)RNA酶的無(wú)菌水溶解RNA。紫外吸收法檢測(cè)RNA純度，A260/A280比值1.8～2.1。使用SuperScript Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Invitrogen公司)合成cDNA。SYBR Green法進(jìn)行RT-PCR，β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)樣品中SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)水平。具體程序：93 ℃ 2 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色取40 g·L-1多聚甲醛中固定的小梁網(wǎng)組織，使用石蠟包埋，連續(xù)切片，厚5 μm，依次放入二甲苯溶液、乙醇溶液，常規(guī)脫蠟脫水，浸入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中高溫煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，待切片自然冷卻后加入內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶浸泡15 min，沖洗，分別加入一抗、二抗反應(yīng)。采用鏈霉素親生物素蛋白-過(guò)氧化物酶標(biāo)法顯色，蘇木精溶液復(fù)染。染色過(guò)程中保持切片濕潤(rùn)。結(jié)果以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)棕黃色顆粒為陰性表達(dá)。

1.2.3氧化應(yīng)激酶檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小梁網(wǎng)組織中過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。POD測(cè)定試劑盒(比色法)購(gòu)于南京建成生物工程研究所，總SOD活性檢測(cè)試劑盒(比色法)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 結(jié)果

2.1小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α的mRNA表達(dá)水平POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1 mRNA和PGC-1α mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，SIRT1和PGC-1α在小梁網(wǎng)組織中均有表達(dá)。SIRT1和PGC-1α主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，且對(duì)照組小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α陽(yáng)性表達(dá)率高于POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α表達(dá)(×400)。A、C為對(duì)照組小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α表達(dá)；B、D為POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α表達(dá)

表1兩組小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1αmRNA表達(dá)水平

組別nSIRT1 mRNAPGC-1α mRNA對(duì)照組300.24±0.070.67±0.21POAG組400.11±0.030.32±0.10t值10.5449.250P值0.0000.000

2.3POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1和PGC-1α表達(dá)的關(guān)系相關(guān)性分析顯示，POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1與PGC-1α表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.759，P=0.006)。見(jiàn)圖2。

圖2 POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1和PGC-1α的表達(dá)相關(guān)性分析圖

2.4小梁網(wǎng)組織中POD和SOD水平POAG組小梁網(wǎng)組織中POD水平高于對(duì)照組，SOD水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2兩組小梁網(wǎng)組織中POD和SOD水平

組別nPOD水平/U·L-1SOD水平/U·L-1對(duì)照組30(73.46±15.81)×103412.57±61.25POAG組40(102.59±22.37)×103347.62±50.73t值6.0794.849P值0.0000.000

2.5POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α表達(dá)與POD、SOD的關(guān)系POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1表達(dá)水平與POD水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.636，P=0.009)，與SOD水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.662，P=0.005)；POAG組小梁網(wǎng)組織中PGC-1α表達(dá)水平與POD水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.737，P=0.000)，與SOD水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.614，P=0.014)。見(jiàn)圖3。

3 討論

POAG是一種病理性眼壓升高且前房角開(kāi)放的青光眼，以視盤(pán)受損和視野障礙為主要特征。流行病學(xué)研究表明，眼壓≥20 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)的患者發(fā)生POAG的風(fēng)險(xiǎn)是眼壓<20 mmHg患者的16.22倍，說(shuō)明高眼壓是POAG的主要病理因素[8]。小梁網(wǎng)位于眼前段并且負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)房水的流出，青光眼中可觀察到小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)變化，并且有大量基因突變，小梁網(wǎng)硬度增大，說(shuō)明小梁網(wǎng)組織變性、硬化、內(nèi)皮細(xì)胞增大等變異是POAG眼壓增高的主要原因，眼壓升高進(jìn)而引起小梁網(wǎng)壓縮，導(dǎo)致小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，增加POAG患眼房水流出阻力[9-10]。因此，探討小梁網(wǎng)組織病變機(jī)制對(duì)臨床POAG降眼壓治療具有一定的指導(dǎo)意義。

SIRT1是細(xì)胞代謝輔酶NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙?；?，有研究表明，H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中SIRT1表達(dá)明顯降低，而上調(diào)SIRT1表達(dá)可減緩氧化應(yīng)激對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響[11]。Ren等[12]研究發(fā)現(xiàn)，青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞中SIRT1表達(dá)低于正常小梁網(wǎng)細(xì)胞，使用H2O2誘導(dǎo)正常小梁網(wǎng)細(xì)胞DNA雙鏈損傷，并將SIRT1轉(zhuǎn)染至受損細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SIRT1轉(zhuǎn)染后受損細(xì)胞修復(fù)能力增強(qiáng)，細(xì)胞衰老延緩，提示SIRT1表達(dá)下調(diào)可能是青光眼發(fā)病危險(xiǎn)因素之一。說(shuō)明SIRT1在小梁網(wǎng)組織中有表達(dá)，且具有抗氧化應(yīng)激作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POAG患者小梁網(wǎng)組織中SIRT1表達(dá)水平明顯低于正常小梁網(wǎng)組織，與Ren等[12]研究結(jié)果一致。PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體生物合成和能量代謝的關(guān)鍵分子，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POAG患者小梁網(wǎng)組織中PGC-1α表達(dá)水平明顯低于正常小梁網(wǎng)組織。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，POAG患者小梁網(wǎng)組織中SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平均降低。白藜蘆醇是SIRT1的天然激動(dòng)劑，有研究表明，白藜蘆醇能夠改善高糖對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體DNA的損傷作用，通過(guò)激活PGC-1α和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A信號(hào)通路改善線粒體功能[13]。

圖3 POAG組小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α表達(dá)與POD、SOD水平的相關(guān)性分析圖。A、B為SIRT1表達(dá)與POD、SOD的相關(guān)性分析圖；C、D為PGC-1α表達(dá)與POD、SOD的相關(guān)性分析圖

POAG患者小梁網(wǎng)細(xì)胞中升高的Ca2+濃度可進(jìn)入線粒體，引起線粒體通透性改變、有氧呼吸功能障礙，產(chǎn)生較多的活性氧，進(jìn)而通過(guò)一系列反饋調(diào)節(jié)機(jī)制促進(jìn)小梁網(wǎng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致POAG患者小梁網(wǎng)功能障礙及眼壓升高，引起視神經(jīng)損傷和視野缺損[14-15]。線粒體產(chǎn)生的活性氧是體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的重要促進(jìn)因素，加強(qiáng)的氧化應(yīng)激可從多種途徑造成小梁網(wǎng)細(xì)胞DNA和溶酶體損傷，引起小梁網(wǎng)細(xì)胞死亡[16-17]。此外，活性氧還可促進(jìn)核因子激活，白細(xì)胞介素等炎癥因子產(chǎn)生，引起小梁網(wǎng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POAG患者小梁網(wǎng)組織中促氧化標(biāo)志物POD水平升高，而抗氧化標(biāo)志物SOD水平降低，說(shuō)明小梁網(wǎng)組織中存在氧化應(yīng)激狀態(tài)。Fu等[19]研究表明，SIRT1的天然激動(dòng)劑白藜蘆醇能夠促進(jìn)線粒體內(nèi)SIRT1富集，并上調(diào)FoxO3a介導(dǎo)的PGC-1α基因表達(dá)，有效降低小鼠腎小管上皮細(xì)胞中線粒體活性氧產(chǎn)生。Fang等[20]研究表明，白藜蘆醇通過(guò)激活SIRT1介導(dǎo)的PGC-1α去乙?；筛纳凭€粒體功能，從而減輕糖尿病小鼠中高葡萄糖誘導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激。本研究相關(guān)性分析顯示，POAG患者小梁網(wǎng)組織中SIRT1水平與PGC-1α水平呈正相關(guān)，且SIRT1和PGC-1α與小梁網(wǎng)組織中異常表達(dá)的POD、SOD有關(guān)，可推測(cè)氧化應(yīng)激導(dǎo)致SIRT1低表達(dá)，降低PGC-1α表達(dá)導(dǎo)致線粒體活性氧產(chǎn)生增加，進(jìn)而加重氧化應(yīng)激水平，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)POAG發(fā)生及進(jìn)展。

綜上所述，POAG小梁網(wǎng)組織中SIRT1、PGC-1α表達(dá)降低，與氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，提示SIRT1、PGC-1α在POAG發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過(guò)激活SIRT1/PGC-1α信號(hào)途徑可能改善小梁網(wǎng)組織線粒體功能，降低氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而降低眼壓，實(shí)現(xiàn)控制及改善POAG，為臨床治療POAG提供了新思路，但其治療效應(yīng)仍需進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。