申杰，李媛，徐桂華#

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2科研處對外合作與成果管理科，呼和浩特010017

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的第三大原因[1]。目前多學(xué)科聯(lián)合治療能夠改善晚期胃癌患者的預(yù)后[2]，雖然治療方面取得了很大的進步，但胃癌患者的預(yù)后仍然較差，5年生存率仍低于40%，主要原因是其具有頻繁復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移和強耐藥性的特點[3]。因此，研究胃癌頻繁復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵機制非常重要。胃癌的耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)可能是由于胃癌干細胞（gastric cancer stem cell，GCSC）的存在[4]。有研究指出，在胃癌中CD44與CD133表達上調(diào)與多種臨床特征及不良預(yù)后相關(guān)，在胃癌患者中聯(lián)合檢測CD44和CD133對疾病診斷、預(yù)測預(yù)后方面具有重要作用[5]。除此之外，干細胞相關(guān)基因也可以作為胃癌的預(yù)后標(biāo)志物。其中，miRNA-501-5p對于維持GCSC的干性至關(guān)重要，還與胃癌患者的生存率呈負相關(guān)，說明miRNA-501-5p也可作為預(yù)后的預(yù)測因子[6]。部分臨床前研究提出通過抑制干細胞相關(guān)基因的表達能夠靶向治療GCSC，這可能為其臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，為胃癌新的預(yù)后標(biāo)志物和有效的治療策略提供了參考。本文主要總結(jié)目前關(guān)于GCSC的調(diào)控機制，有助于系統(tǒng)地了解GCSC，以期為胃癌發(fā)生機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 GCSC的分離與鑒定

GCSC的分離、鑒定是研究其潛在機制和功能的關(guān)鍵。多項研究表明，在添加生長因子的無血清懸浮培養(yǎng)基中，腫瘤干細胞可以形成球狀細胞，保持自我更新特性。這些細胞具有無限增殖、自我更新的特性，并有相關(guān)基因表達增加，如CD44、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）、性別決定區(qū)Y-box轉(zhuǎn)錄因子2（sex determining region Y-box transcription factor 2，SOX2）、ATP結(jié)合亞族G成員2（ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）、NANOG 等[7-8]，因此成球?qū)嶒灡徽J為是獲得GCSC的一種簡便方法。然而由于缺乏微環(huán)境的刺激，在成球過程中干細胞的特性可能發(fā)生改變。利用Hoechst 33342標(biāo)記GCSC，能夠通過流式細胞儀從側(cè)群細胞（side population cell，SP）中富集 GCSC[9]。胃癌細胞中的SP對5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）和多柔比星具有較強的耐受能力，移植到免疫缺陷的NOG小鼠后，產(chǎn)生腫瘤的能力增強[10]。但由于Hoechst 33342對細胞有毒性，可能會對實驗的準(zhǔn)確性造成一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)利用長春新堿處理胃癌細胞能夠顯著增加腫瘤球形成能力，并使干細胞相關(guān)基因的表達增加，如CD44、SOX2、Oct4和Musashi-1，這表明長春新堿處理也可用于富集GCSC[11]。

盡管GCSC分離標(biāo)志物的特異性存在爭議，但越來越多的證據(jù)表明這些標(biāo)志物也能用來富集GCSC。CD44是第一個被發(fā)現(xiàn)的GCSC表面標(biāo)志物，在腫瘤細胞對微環(huán)境的反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，SCID小鼠被注射（2～3）×104個CD44陽性胃癌細胞8～12周后，在皮膚和胃均能產(chǎn)生腫瘤；而注射（3～10）×104個CD44陰性胃癌細胞則不能產(chǎn)生腫瘤，表明CD44陽性胃癌細胞具有強致瘤性。此外，CD44陽性胃癌細胞還表現(xiàn)出較強的腫瘤球形成能力、耐化療能力和耐輻射能力[12-13]。同時表達CD44/CD24可用于富集胃癌中的GCSC[14]，與CD44/CD24均為陰性的細胞相比，CD44/CD24均為陽性的腫瘤細胞具有自我更新、增殖和腫瘤易復(fù)發(fā)的能力。從外周血中分離出的CD44/CD54均為陽性的細胞自我更新能力增強，表明CD44/CD54均為陽性的細胞可用于腫瘤組織及外周血中GCSC的鑒定[15]。RNA結(jié)合蛋白Musashi-1在維持干細胞未分化狀態(tài)中發(fā)揮著重要作用[16]。并且CD44/Musashi-1也可作為富集GCSC的表面標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)CD44/Musashi-1均為陽性的胃癌細胞的增殖、自我更新能力和耐藥性均有所提高[17]。上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）結(jié)合CD44也可用于富集GCSC[18]。其他一些分子如CD90、CD71和富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5（leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，LGR5），也被報道具有成為GCSC候選表面標(biāo)志物的潛力[4,19-20]。

2 編碼蛋白質(zhì)的基因?qū)CSC干性的調(diào)控

GCSC中一些異常表達的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白質(zhì)在維持GCSC中發(fā)揮著重要作用。磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphoryhted-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）介導(dǎo)GCSC中CD44和Oct4正反饋回路，參與維持胃癌細胞的干細胞特性，如耐藥性、高致瘤性和轉(zhuǎn)移能力。同時，通過選擇性mRNA剪接產(chǎn)生的CD44變異體（CD44 variant，CD44v）也有助于維持胃癌細胞的干細胞特性。xCT是谷氨酸-胱氨酸交換轉(zhuǎn)運體的輕鏈亞基，通過參與胱氨酸攝取和谷胱甘肽合成，在細胞內(nèi)氧化還原平衡中發(fā)揮重要作用。CD44v可以與xCT相互作用，增加細胞內(nèi)谷胱甘肽含量，進而增加胃癌細胞對氧化應(yīng)激的抵抗力[21]。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)晚期胃癌患者接受xCT抑制劑柳氮磺胺吡啶治療后，陽性表達CD44v的干細胞比例降低，提示柳氮磺胺吡啶聯(lián)合化療可能改善胃癌患者的預(yù)后。另一種與干細胞相關(guān)的SOX2在GCSC中表達增加，對腫瘤球形成能力和多柔比星抗性有顯著作用[22]。干細胞相關(guān)基因BMI1在SGC7901和MKN45細胞系的球形細胞中過表達，且BMI1與Oct4、SOX2、NANOG、CD44、CD133等多種干細胞標(biāo)志物表達呈正相關(guān)。BMI1能夠通過蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路介導(dǎo)miRNA-21的激活，對干細胞干性有正向調(diào)控作用[23]。

許多研究已經(jīng)明確了經(jīng)典的干細胞相關(guān)信號通路在GCSC中具有調(diào)節(jié)作用。WNT/β-catenin通路在維持干細胞特性中的重要作用受到越來越多的關(guān)注[24]。據(jù)報道，溶質(zhì)載體家族34成員2（solute carrier family 34 member 2，SLC34A2）可誘導(dǎo)激活WNT/β-catenin信號，以及增強CD44陽性GCSC的自我更新和耐藥能力。進一步研究顯示，SLC34A2通過結(jié)合miRNA-25啟動子區(qū)域能上調(diào)miRNA-25的表達，從而抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase 3β，GSK3β）表達，激活WNT/βcatenin信號通路[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，在CD44陽性胃癌細胞中Notch1信號通路被激活。γ-分泌酶能抑制Notch1的自我更新、腫瘤發(fā)生和CD44陽性胃癌細胞的遷移能力以及化療耐藥性，表明Notch1信號對GCSC至關(guān)重要[26]。

3 非編碼RNA對GCSC干性的調(diào)控

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）大致分為兩類：小于等于200個核苷酸的小RNA和大于200個核苷酸的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。越來越多的證據(jù)顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）在GCSC中具有調(diào)控功能。通過miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，MKN-5細胞通過流式細胞儀分選出SP與其他細胞之間的miRNA表達模式存在差異[27]。球狀體形成細胞與MKN-5細胞系的親本細胞miRNA表達模式也有顯著差異。這些miRNA與調(diào)控多能性的信號通路有關(guān)，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/SMAD、WNT/β-catenin 和 Notch 信號通路[28-29]。因此，miRNA表達活性也參與調(diào)控GCSC干細胞特性的調(diào)控。

miRNA-196-5p能調(diào)控CD44陽性GCSC的活性，其調(diào)控機制為直接抑制3'-UTR SMAD4表達從而增強CD44陽性GCSC的自我更新能力[30]。與此同時，miRNA-106b通過激活TGF-β/SMAD信號通路，能夠使GCSC維持干細胞特性[29]。報道稱一些miRNA可能通過WNT/β-catenin途徑對GCSC的特性起到調(diào)控作用。例如，miRNA-483-5p通過激活WNT/β-catenin信號通路可以促進GCSC生長和自我更新[31]。miRNA-501-5p通過直接下調(diào)Dickkopf相關(guān)蛋白1（dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1，DKK1）、WNT信號通路NKD抑制劑（NKD inhibitor of WNT signaling pathway 1，NKD1）、GSK3β表達激活WNT/β-catenin信號通路，有助于增強GCSC的干細胞特性[6]。在CD44/EPCAM均為陽性的胃癌細胞的成球過程中，miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a表達逐漸下降。miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a可顯著增強GCSC的耐藥性、自我更新能力和致瘤性，其機制推測為miRNA-19b、miRNA-92a、miRNA-20a可直接抑制WNT通路的阻滯劑E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）和同源域相互作用蛋白激酶1（homeodomain interacting protein kinase 1，HIPK1），進而激活WNT/β-catenin信號通路。通過分析97例胃癌患者胃癌組織中的miRNA-92a表達水平發(fā)現(xiàn)，miRNA-92a可作為胃癌的預(yù)后因子[32-33]。同時，miRNA也可以調(diào)控Notch信號通路，進一步調(diào)控GCSC的多能性。

N2IC是Notch2受體的活化形式，其通過上調(diào)環(huán)氧化酶-2導(dǎo)致胃癌發(fā)生[34]。研究發(fā)現(xiàn)，GCSC中N2IC、ETS原癌基因1（ETS proto-oncogene 1，ETS1）、miRNA-23b的負反饋通路，在調(diào)控GCSC多能性中發(fā)揮重要作用[35]。通過沉默N2IC、ETS1，可抑制腫瘤球形成能力，并使CD44、Nanog、SOX2等干性基因的表達降低。過表達N2IC和ETS1可能起到相反的作用，刺激E2F1的表達，進而抑制miRNA-23b的表達。并且研究發(fā)現(xiàn)ABCG2通過SP調(diào)控維持干細胞特性，促進胃癌耐藥性[36]。miRNA-132可以增強LGR5陽性GCSC患者對順鉑的耐藥性，可以直接抑制SIRT1的表達維持CERB的活化，最后導(dǎo)致ABCG2的表達水平增加[5]。

lncRNA作為ncRNA的一員，通過與DNA、RNA、蛋白相互作用調(diào)控染色質(zhì)重疊、選擇性剪接和轉(zhuǎn)錄機制，以順式或反式的方式調(diào)控基因表達[37]。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA調(diào)控蛋白在GCSC中具有調(diào)控作用[38]。在CD133陽性的GCSC中過表達lncRNA調(diào)控蛋白，能促進GCSC的增殖和侵襲，同時可上調(diào)Oct4、SOX2、NANOG等多能基因的表達。

4 GCSC的臨床研究進展

胃癌頻繁復(fù)發(fā)可能主要是由于對非GCSC抗腫瘤治療引起的[39]。由于GCSC在耐藥性和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，針對維持腫瘤干細胞關(guān)鍵靶分子的治療可以改善胃癌患者預(yù)后[40]。目前提出幾種關(guān)于干性相關(guān)基因的靶向療法用于特異性消除GCSC。

納米技術(shù)具有在特定部位裝載診斷和治療化合物的能力，有助于腫瘤預(yù)防、診斷和治療[41-42]。CD44在GCSC中具有重要作用，利用抗體引導(dǎo)CD44靶向治療也是種有效的抗腫瘤策略。在Ⅰ期臨床試驗中測試了幾種CD44v6-特異性抗體，均具有良好的腫瘤靶向治療效果[43-44]。合成的納米探針GNS-PEG-CD44v6通過干擾CD44的功能，誘導(dǎo)CD44陽性細胞介導(dǎo)的GCSC清除，進一步調(diào)控腫瘤形成。在小鼠皮下注射GNS-PEG-CD44v6標(biāo)記的GCSC細胞，照射紅外激光兩周后發(fā)現(xiàn)，腫瘤體積減小，表明該探針在GCSC靶向治療中的潛在應(yīng)用[45]。

RNA干擾誘導(dǎo)小分子工具正在開發(fā)中，用于抑制干細胞相關(guān)基因的表達。miRNA-34a通常在腫瘤組織中表達下調(diào)，是CD44的負調(diào)控因子[46]。納米囊泡介導(dǎo)的PLI/miRNA-34a通過納米級穩(wěn)定的miRNA-34a遞送系統(tǒng)靶向GCSC，在體內(nèi)顯著抑制CD44表達，并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，具有良好的抗腫瘤作用[47]。聯(lián)合應(yīng)用核酸和抗腫瘤藥物也是減少腫瘤干細胞和非腫瘤干細胞數(shù)目的有效方法。含有miRNA-200c和多西紫杉醇（docetaxel，DOC）的穩(wěn)定凝膠刺激納米顆粒具有較好的腫瘤細胞靶向能力和協(xié)同抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-200c/DOC納米顆?？梢愿纳艵-鈣黏蛋白表達，降低CD44表達，降低腫瘤形成能力[48]。

此外，分化治療也是種有效抑制腫瘤干細胞增殖的方法。無調(diào)性bHLH轉(zhuǎn)錄因子1（atonal bHLH transcription factor 1，ATOH1）是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在誘導(dǎo)腸上皮細胞分化中起重要作用[49]。GCSC中ATOH1的過表達能夠降低干性基因的表達水平，同時增加各種分化標(biāo)志物的表達，進而降低體外GCSC的成球能力以及體內(nèi)腫瘤形成能力[50]。這表明ATOH1可作為分化療法用于根除GCSC。全反式維甲酸（alltrans retinoic acid，ATRA）被證明可有效誘導(dǎo)GCSC的分化，表現(xiàn)為胃上皮分化標(biāo)志物的表達增加，如細胞角蛋白、黏蛋白6（mucins 6，MUC6）和三葉肽因子3（trefoil factor 3，TFF3）；并且治療后腫瘤球中干細胞相關(guān)基因表達下調(diào)。ATRA預(yù)處理的腫瘤球注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，不會產(chǎn)生腫瘤；當(dāng)用33 μmol/kg ATRA處理后注射，可明顯抑制腫瘤生長。說明ATRA可誘導(dǎo)GCSC分化，消除GCSC[51]。

5 小結(jié)與展望

目前在GCSC所涉及的分子調(diào)控機制方面已經(jīng)取得了很大的成就。干細胞相關(guān)的mRNA、蛋白和ncRNA在干細胞特性調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，有望成為胃癌患者預(yù)后標(biāo)志物或特異性靶點。越來越多的證據(jù)表明GCSC在耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用[52-53]。干細胞相關(guān)基因可能對腫瘤干細胞發(fā)展有幫助，也可能與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。這也表明GCSC在胃癌中的重要性，靶向清除GCSC可能是提高惡性腫瘤患者預(yù)后的最有效方法。分化療法、納米技術(shù)和基于當(dāng)代表觀遺傳工具的療法，在抑制GCSC方面具有應(yīng)用前景。未來需要進一步評估其體內(nèi)效應(yīng)，確定其是否可以改善胃癌患者的預(yù)后。為了實現(xiàn)GCSC靶向治療在臨床中的應(yīng)用，仍有許多工作要做。此外，正常干細胞與GCSC有一些共同的干性相關(guān)基因，如何在不影響正常組織干細胞的情況下選擇性靶向GCSC仍然是一個很大的難題，有待進一步研究。