余小花，占 靜，馬 瑞，魏 柏

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湖北 武漢 430077

肝癌是常見的消化道腫瘤，目前化療是晚期肝癌的主要治療手段之一，然而多藥耐藥常常限制了肝癌的治療療效[1]。近年來，逐步有學(xué)者解釋HBV在肝癌多藥耐藥發(fā)生、發(fā)展中可能起到一定作用，但其作用機(jī)制尚未明確[2]。因此，本研究以整合了HBV DNA的HepG2.2.15細(xì)胞來模擬被HBV感染狀態(tài)[3]，利用基因芯片技術(shù)研究肝癌細(xì)胞HepG2.2.15和HepG2的基因表達(dá)差異，通過尋找差異基因表達(dá)為后續(xù)研究HBV相關(guān)的肝癌多藥耐藥發(fā)展的分子機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，HepG2.2.15細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院盧銀平教授饋贈(zèng)?；蛐酒瑸锳ffymetrix的GeneChip primeview human；基因芯片雜交，洗滌和染色試劑盒購(gòu)自GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit；RNA質(zhì)檢為Agilent RNA 6000 Nano試劑盒；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)液，RNA提取試劑Trizol和PCR試劑Power SYBR?Green PCR Master Mix購(gòu)自Life Technologies公司；PCR引物購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)：肝癌細(xì)胞株HepG2和HepG2.2.15采用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。生長(zhǎng)至60%～80%時(shí)融合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RNA抽提和質(zhì)檢：采用Trizol法進(jìn)行樣品的總RNA抽提，抽提所得總RNA送至上海吉?jiǎng)P生物公司使用NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100質(zhì)檢，合格樣本進(jìn)入基因芯片和Real time-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 基因芯片檢測(cè)差異基因：質(zhì)檢合格的RNA樣品由上海吉?jiǎng)P生物公司使用Affymetrix公司提供的“GeneChip primeview human 100 format”芯片進(jìn)行基因芯片分析。將篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為：P<0.05且fold change (|FC|) ≥2，通過Gene Ontology功能進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因的生物過程進(jìn)行分析，根據(jù)表達(dá)強(qiáng)弱排序后，我們選取前十位加以展示。

1.2.4 Real time-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果：用Tirzol提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板行Real time-PCR檢測(cè)MDR1、MRP2、LRP和GST的表達(dá)(見表1)。

表1 驗(yàn)證基因引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab 1 The sequence and length of gene primer

2 結(jié)果

2.1總RNA質(zhì)控提取HepG2細(xì)胞及HepG2.2.15細(xì)胞的總RNA，其A260/A280為1.7～2.2，RIN≥7.0，28S/18S>0.7，證實(shí)已提取到高純度的RNA(見表2)。

表2 RNA樣本質(zhì)檢結(jié)果Tab 2 RNA quality

2.2基因芯片分析差異表達(dá)基因與生物學(xué)信息分析以肝癌細(xì)胞株HepG2和HepG2.2.15為研究對(duì)象，通過基因芯片篩選到差異表達(dá)的基因1 263個(gè)，其中上調(diào)基因數(shù)671個(gè)，下調(diào)基因數(shù)592個(gè)(見圖1)。

注：橫軸代表聚類分析的樣品，縱軸代表差異基因，顏色代表Log10轉(zhuǎn)換后的表達(dá)量。

2.3藥物相關(guān)差異表達(dá)基因生物過程分析以肝癌細(xì)胞HepG2和HepG2.2.15為研究對(duì)象，通過Gene Ontology功能進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因的生物過程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)和藥物相關(guān)基因58個(gè)，其中上調(diào)基因數(shù)31個(gè)，下調(diào)基因數(shù)27個(gè)。涉及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、藥物代謝相關(guān)基因、細(xì)胞增殖相關(guān)基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因等。根據(jù)表達(dá)強(qiáng)弱值排序后，我們選取前十位加以展示(見表3～4)。

2.4Realtime-PCR驗(yàn)證基因芯片中表達(dá)差異基因根據(jù)既往研究結(jié)果和本次差異表達(dá)基因，選擇了4個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞比較，利用Real time-PCR檢測(cè)MDR1、MRP2和LRP基因在HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)量增高，但GST未見明顯變化。將其在芯片中的FC值和Real time-PCR結(jié)果中的差異倍數(shù)進(jìn)行比較，可見上述基因表達(dá)變化與基因芯片一致，說明基因芯片結(jié)果可靠(見圖2、表5)。

表4 藥物相關(guān)差異表達(dá)下調(diào)基因的功能富集分析Tab 4 Functional enrichment analysis of down-regulated drug resistance related genes

圖2 部分多藥耐藥基因在RNA水平的表達(dá) Fig 2 Drug resistance related genes expression at mRNA level

表5 差異表達(dá)基因的Real time-PCR驗(yàn)證結(jié)果 Tab 5 The results of Real time-PCR validation of gene expression in differentially expressed genes

3 討論

既往研究表明，肝癌多藥耐藥可能涉及多階段、多基因的參與，前期我們的團(tuán)隊(duì)和其他學(xué)者也證實(shí)了HBV參與多藥耐藥基因的調(diào)控，但其確切機(jī)制尚未闡明[4-6]。與傳統(tǒng)的研究方法相比，基因芯片可以獲得大量差異表達(dá)基因，從而實(shí)現(xiàn)從全局來預(yù)測(cè)這些基因的功能和基因間的相互關(guān)系[7]。因此，本研究利用基因芯片技術(shù)得到差異表達(dá)基因1 263個(gè)，進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)藥物相關(guān)基因58個(gè)，涉及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、藥物代謝相關(guān)基因、細(xì)胞增殖相關(guān)基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因等。

本研究結(jié)果表明，在藥物相關(guān)基因中上調(diào)最為明顯的是CDH1、SEMA3C和FOS等。CDH1是E鈣黏蛋白的編碼基因，CDH1過甲基化常導(dǎo)致其功能喪失，最終引起腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥等，進(jìn)一步研究表明，肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDH1增強(qiáng)多柔比星的攝取，減少M(fèi)DR1的表達(dá)及細(xì)胞凋亡[8]。SEMA3C在肝癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，并起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，在體外細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，SEMA3C通過ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而影響細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[9]。原癌基因c-FOS是即刻早期基因家族中的一員，通過和c-JUN、ATF/CREB家族成員形成異源二聚體，識(shí)別細(xì)胞內(nèi)特定的DNA序列，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起非常重要的作用。近年來,原癌基因c-FOS在腫瘤耐藥中的作用漸受重視，對(duì)其進(jìn)行研究有助于認(rèn)識(shí)和了解腫瘤化療過程中所出現(xiàn)的多藥耐藥相關(guān)的分子機(jī)制[10]。

本研究結(jié)果提示，在藥物相關(guān)表達(dá)下調(diào)的27個(gè)基因中有代表性的是ABCG2、ARG1和CYP1A1等。ABCG2在多種實(shí)體瘤中均有表達(dá)，且越來越多的研究揭示了ABCG2和多藥耐藥的相關(guān)性[11-12]，但涉及的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。ARG1是近幾年發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于肝癌細(xì)胞的免疫標(biāo)志物[13]，有研究表明，轉(zhuǎn)染ARG1的293T細(xì)胞誘導(dǎo)了MRP和GST等耐藥相關(guān)基因表達(dá)，推測(cè)其在克服腫瘤耐藥提供新的治療靶點(diǎn)可能具有重要的意義。CYP1A1主要代謝多環(huán)芳烴，間接參與了腫瘤的發(fā)生[14]，然而對(duì)于不同腫瘤化療療效的影響值得進(jìn)一步探索[15]。

既往研究表明，肝癌多藥耐藥與ABCB1、MRP2、LRP和GST-pi異常表達(dá)相關(guān)[16-20]，以這些基因?yàn)榘悬c(diǎn)改變藥物泵或代謝酶活性從而逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞多藥耐藥也逐漸受到廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用Real time-PCR檢測(cè)了上述基因在HepG2.2.15及HepG2中的異常表達(dá)，再次驗(yàn)證HBV參與了肝癌多藥耐藥的調(diào)節(jié)，同時(shí)也表明基因芯片結(jié)果可信。

本研究應(yīng)用基因芯片篩選了HBV對(duì)肝癌細(xì)胞藥物代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，在基因功能分析中獲取了HBV可能作用的與多藥耐藥相關(guān)的靶基因，此外實(shí)驗(yàn)采用Real time-PCR檢測(cè)了HBV對(duì)目前常見多藥耐藥基因表達(dá)的影響，驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性，提示這些基因可能成為臨床逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的新靶點(diǎn)，為深入探討HBV在肝癌中的作用提供了新的線索。然而本研究中采用的芯片結(jié)果主要反映了基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化，仍具有一定局限性，尚需進(jìn)一步研究。