張 斌，丁慎華，徐春江，許智玲，朱薇珊

復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院 1. 肝病科； 2.高壓氧科，上海 201700

原發(fā)性肝癌是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，其全球發(fā)病率和死亡率分別居所有腫瘤的第7位和第4位[1]，因其惡性程度高、病情進展快，患者早期一般無不適，常在局部播散或發(fā)生遠處轉移后才被診斷，故治療難度大，療效及預后差，目前對其機制還不清楚[2-4]，因而積極探索肝癌發(fā)病機制是肝癌防治的關鍵。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路在細胞的生長、分化、增殖、遷移和存活上扮演了重要的角色，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[5-6]。同時，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染是肝細胞癌發(fā)病的獨立高危因素，整合的HBV DNA基因組編碼的乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是一種重要的反式作用因子，能廣泛激活多種原癌基因的轉錄表達，是肝細胞惡性轉化的重要原因，被認為在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮直接促癌作用[7-9]。為此，本研究構建過表達HBx的真核表達載體，并轉染HepG2肝癌，探索肝癌增殖的情況，同時研究其與PI3K/AKT表達的相關性，為肝癌防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細胞株：人肝癌細胞HepG2由中國科學院上海細胞庫提供。細胞置于質量濃度為100 g/L胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分數為5% CO2充分濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.1.2 主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(100×)、質量濃度為2.5 g/L胰酶-EDTA和Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自Thermo Fisher Scientific公司；小牛血清購自四季青公司，批號090325；四甲基偶氮哇藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；Trizol RNA提取試劑購自Invitrogen公司；鼠抗人SEPP1單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗人GAPDH單克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器：多功能倒置相差顯微鏡(Olympus CK40)，日本OLYMPUS公司產品；CO2培養(yǎng)箱(APT. Line CB CO2-Incubators)，Binder公司產品；CKX41熒光倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)；超凈工作臺，上海凈化設備廠產品；ELX-800全自動酶標儀(BioTek Synerge 2，BioTek Instruments)；96孔培養(yǎng)板，Nunc公司；PB602-SA電子天平，MettlerToledo公司產品。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將凍存于液氮中的HepG2肝癌細胞接種于質量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分數為5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞處于對數生長期時進行傳代，每2～3 d換液1次，長滿后常規(guī)胰蛋白酶消化法傳代培養(yǎng)。48 h后收集細胞進行實驗。

1.2.2 重組表達載體的構建及鑒定：用限制性內切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ對Plvx-ires-zsgreen1表達載體和目的片段分別進行雙酶切，酶切產物采用DNA凝膠回收試劑盒回收，取4 μl回收后的目的片段與2 μl載體，用1 μl T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌，接種于含氨芐的LB平板上培養(yǎng)，37 ℃過夜培養(yǎng)，次日挑單克隆擴大培養(yǎng)并小量提取質粒，對提取的重組質粒進行EcoR Ⅰ單酶切鑒定，同時進行PCR擴增并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。將鑒定結果正確的質粒和陽性菌送到上海華大基因生物公司進行測序。

1.2.3 螢光素酶活性的檢測：培養(yǎng)24 h后棄去孔中的培養(yǎng)基，加入足量的PBS洗滌肝癌細胞2次，每孔中加入200 μl 1×CCLR(Cell Culture Lysis Reagent)，室溫搖動孵育15 min，充分溶解細胞，吸取細胞裂解液轉移至1.5 ml離心管中，渦旋15 s，室溫，12 000×g離心15 s，吸取上清液備用。按照E1500熒光檢測試劑盒說明書，以每孔取20 μl細胞裂解上清液混合20 μl Luciferase Assay Reagent的比例進行操作，使用Glomex螢光素酶檢測儀分別檢測得到各組細胞的螢光素酶熒光值，每組實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖：將處于對數生長期細胞以1×104濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，實驗分組如下：(1)肝癌細胞空白組；(2)pcDNA3.1組：將空質粒pcDNA3.1轉染肝癌細胞后進行培養(yǎng)；(3)pcDNA3.1-HBx組：將HBx轉染肝癌細胞后進行培養(yǎng)；(4)LY294002組(50 μmol/L)：采用PI3K通路抑制劑LY294002干預肝癌細胞。各組肝癌細胞培養(yǎng)箱孵育24 h后棄培養(yǎng)液，加入各組溫育液，每組設10 個復孔，每孔200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)于24 h、48 h 后加入5 g/L MTT 液，20 μl/孔，置孵箱中再培養(yǎng)，4 h后吸去各孔上清，用PBS輕輕地清洗2次，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩器上振蕩10 min，于酶標儀490 nm波長處測各孔吸光度(OD值)。抑制率(%)=(1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.2.5 Western blotting檢測PI3K、AKT蛋白水平：以RIPR裂解液[50 mmol/L Tris(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，質量濃度為10 g/L的NP-40，質量濃度為5 g/L的脫氧膽酸鈉，質量濃度為1 g/L的SDS]收獲細胞，4 ℃條件下12 000×g離心15 min，取上清液并測定蛋白濃度；蛋白上樣量為20 μg，SDS PAGE膠濃度為8%，蛋白被轉移至0.45 μm PVDF膜上，孵一抗(PI3K、AKT、GAPDH抗體均為1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗滌3次，孵二抗1∶2 000，室溫孵育2 h；TBST洗滌6次；ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像、采用Image J圖像軟件進行灰度值計算。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx的構建及鑒定將pcDNA3.1(+)酶切片段與HBx片段連接，陽性克隆通過Xho Ⅰ和Xba Ⅰ進行雙酶切，用于連接和轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑單克隆，提取質粒，再用限制性內切酶Xho Ⅰ對重組質粒進行單酶切鑒定，電泳結果顯示有235 bp的HBx條帶和4 128 bp的載體條帶，與預期片段大小相符，經測序進一步證明插入基因正確，獲得pcDNA3.1(+)-HBx載體，表明HBx表達載體構建成功(見圖1～2)。

注：Marker: DLTM 1000；1: 空的pcDNA3.1(+)質粒；2: pcDNA3.1(+)-HBx質粒。

2.2熒光素酶相對活性檢測經雙熒光素酶表達水平檢測，發(fā)現HBx轉染組較pcDNA3.1(+)空載體組在HBx表達活性上差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖3)，為進一步深入研究HBx在肝癌發(fā)病中的機制提供條件。

2.3肝癌細胞增殖比較通過各組細胞抑制率比較發(fā)現，HBx轉染組有促進肝癌細胞增殖的作用，而LY294002對肝癌細胞有抑制作用，而空質粒轉染組作用不明顯(見表1)。

2.4HBx過表達對肝癌細胞PI3K、AKT蛋白表達的影響通過各組肝癌細胞蛋白表達水平比較，發(fā)現HBx克隆組有促進肝癌細胞AKT及PI3K蛋白表達的作用，而LY294002有顯著抑制肝癌細胞AKT蛋白表達的作用，對PI3K蛋白表達作用不顯著(見圖4～6)。

圖2 重組pcDNA3.1(+)-HBx進行基因擴增后HBx部分測序Fig 2 Partial sequencing of HBx gene amplification by recombinant vector pcDNA3.1(+)-HBx

注：與pcDNA 3.1(+)比較，**P<0.01。

組別OD值抑制率/%肝癌細胞空白組1.26±0.10c—pcDNA3.1組1.29±0.23c-2.3pcDNA3.1-HBx組1.68±0.16bc-28.57LY294002組0.66±0.09a47.62

注：與肝癌細胞空白組比較，aP<0.01，bP<0.05；與LY294002組比較，cP<0.01，dP<0.05。

注：與肝癌細胞空白組比較，**P<0.01；*P<0.05。

注：與肝癌細胞空白組比較，**P<0.01。

注：A：肝癌細胞空白組；B：pcDNA3.1組；C：pcDNA3.1-HBx組；D：LY294002組。

3 討論

HBV慢性感染是肝細胞癌發(fā)病的獨立高危因素。整合的HBV DNA基因組編碼的HBx是一種重要的反式作用因子，能廣泛激活多種原癌基因的轉錄表達，是肝細胞惡性轉化的重要原因，被認為在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮直接促癌作用[7]。HBx蛋白可干擾癌細胞間的黏附連接，促進細胞外基質降解，誘導肝癌細胞發(fā)生上皮間葉表型轉化(epithelial-mensenchymal transition，EMT)，促進肝細胞癌侵襲轉移。HBx在肝癌發(fā)病中與多種信號通路的參與密切相關，其中WANG等[8]將HBx基因轉染HepG2肝癌細胞后發(fā)現有促進腫瘤增殖的作用，其機制與PI3K信號通路的激活有關。LIU等[9]采用轉染HBx基因的肝癌細胞接種裸鼠后發(fā)現有促進腫瘤轉移的作用，其機制與PI3K信號通路的激活也有關。本研究成功構建了過表達HBx的真核表達載體，通過轉染癌細胞HepG2后，發(fā)現HBx的過表達有顯著促進肝癌細胞增殖的作用，表明HBx與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

PI3K是一種脂類激酶，可以催化磷脂酰肌醇D3磷酸化。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是存在于上述兩種信號傳導通路的重要因子，同時也是激活PI3K下游最主要的信號分子。AKT基因控制細胞內mRNA的翻譯，參與膜蛋白轉運、蛋白質降解及核糖體合成等一系列生理生化過程[5]。PI3K/AKT信號通路是一條廣泛存在于細胞中的信號傳導通路。在細胞增殖調控中起重要作用，其主要信號分子包括PI3K、PDK1和AKT。活化的PI3K可將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)轉化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)；PIP3可使其主要下游底物AKT準確定位到近膜區(qū)并發(fā)生構象變化，同時活化的AKT轉位到細胞質和細胞核內，作用于下游底物，調控細胞代謝、蛋白合成、細胞增殖與凋亡等重要生理過程[10-13]，是一種參與細胞生長、增殖、分化調節(jié)的信號傳導通路。PI3K和AKT表達異常存在多種癌細胞中，與肝癌關系也很密切[14-15]。本研究中也發(fā)現，過表達HBx促進肝癌細胞增殖的同時，有上調PI3K及AKT表達的作用，表明HBx的過表達有促進肝癌細胞增殖的作用，其機制部分與上調AKT/PI3K的表達有關，值得進一步深入研究。