王 蕾，馬 軍，劉宗文，王 健，張中冕，張 玲，張 芳，周士霞,張萌迪,邢儀通，孫甜甜，馬佳康，段芳齡

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1.放射科； 2.檢驗(yàn)科； 3.放療科； 4.腫瘤科；河南 鄭州 450014； 5.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科； 6.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU； 7.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，腫瘤相關(guān)死亡率位列前三位[1]，其致癌作用主要與肝炎病毒、飲酒、脂肪肝等引起的肝炎或肝硬化有關(guān)。HCC的診斷主要依靠病史、血清AFP水平及超聲、CT或磁共振等影像學(xué)檢查，由于缺乏高靈敏度和特異度的標(biāo)志物，早期診斷難以實(shí)現(xiàn)，治療效果不能令人滿意，因此，有必要進(jìn)一步尋找更有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

GOLM1(GP73)是高爾基體跨膜蛋白，在HCC組織中表達(dá)。一些數(shù)據(jù)顯示，血清GOLM1是診斷HCC的可靠生物標(biāo)志物，其靈敏度和特異度可能優(yōu)于目前使用的生物標(biāo)志物，如AFP[2-3]。然而，最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，GOLM1在良性肝臟疾病中也有表達(dá)，甚至肝硬化患者血清GOLM1水平也顯著高于HCC患者[4-5]，因此對于GOLM1在HCC診斷中的作用還需要進(jìn)一步探討。

非編碼RNA，包括miRNA(微小RNA)、lncRNA(長鏈非編碼RNA)等，對基因表達(dá)的調(diào)控越來越受到重視，并有可能對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，在HCC中，也發(fā)現(xiàn)多個(gè)非編碼RNA與其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，這些基因既可作為腫瘤診斷的潛在標(biāo)志物，也可成為治療靶點(diǎn)[6-7]。

本研究分析了來自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫中HCC相關(guān)病變中GOLM1 mRNA的表達(dá)，用組織芯片和免疫組化(IHC)技術(shù)驗(yàn)證HCC組織和癌旁組織中GOLM1蛋白的表達(dá)，并用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測其相關(guān)的非編碼RNA。

1 材料與方法

1.1在線數(shù)據(jù)分析GOLM1mRNA在HCC中的表達(dá)使用Oncomine(https://www.oncomine.org/)和UALCAN(http：//ualcan. path.uab.edu/)在線工具，分析公開數(shù)據(jù)庫中GOLM1 mRNA在HCC患者中的表達(dá)，并從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載HCC患者mRNA和非編碼RNA測序數(shù)據(jù)和臨床病理信息，進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2GOLM1蛋白的組織芯片免疫組化染色和病理臨床特征的相關(guān)性分析包含90例HCC患者成對癌組織和癌旁組織標(biāo)本的組織陣列來自上海Outdo生物技術(shù)有限公司(HLivH180Su06，SOBC，中國上海)，詳細(xì)信息可以在線下載(http：//www.superchip.com.cn/biology/tissue.html)。手術(shù)時(shí)間為2006年2月至2007年5月，隨訪時(shí)間截止至2012年2月。免疫組化具體方法為常規(guī)脫蠟、水化和抗原熱修復(fù)的組織標(biāo)本，商業(yè)阻斷劑(邁新生物技術(shù))用于阻斷非特異性染色。將組織芯片加抗人GOLM1抗體(Santa Cruez，sc-365817，1∶100)在4 ℃下孵育過夜；用PBS沖洗，加二抗(SP試劑盒)孵育1 h；PBS洗凈后，進(jìn)行DAB顯色、蘇木精復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對照。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分比，由2名未知臨床病理特征的研究人員評估IHC染色結(jié)果。顏色強(qiáng)度評分:無顏色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；深棕色，3分。陽性細(xì)胞百分率：<10%，0分；10%～30%，1分；>30%，3分。利用兩者的積分，評價(jià)標(biāo)本結(jié)果，綜合評分>3為陽性病例。

1.3TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載和分析下載TCGA數(shù)據(jù)庫中的HCC轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，利用R和Perl軟件進(jìn)行mRNA、miRNA和lncRNA差異譜分析，矯正后P值設(shè)定為0.05，差異倍數(shù)logFC設(shè)定為2，并進(jìn)行共表達(dá)分析和靶基因預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1HCC、肝纖維化和不典型增生組織GOLM1mRNA表達(dá)升高首先，我們使用Oncomine在線數(shù)據(jù)，進(jìn)行HCC中GOLM1 mRNA表達(dá)的Meta分析，在4個(gè)HCC與正常對照研究中，GOLM1 mRNA均顯示為高表達(dá)基因(見圖1A)。接著用UALCAN在線工具對TCGA數(shù)據(jù)中的HCC和正常對照組的GOLM1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，在HCC中GOLM1的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織；另外，我們下載了TCGA轉(zhuǎn)錄組表達(dá)和部分病理臨床數(shù)據(jù)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),GOLM1 mRNA表達(dá)與HCC的分級、患者臨床分期及總生存時(shí)間相關(guān)(見圖1B、表1)。

圖1在線數(shù)據(jù)分析GOLM1mRNA在HCC中的異常表達(dá)A：GOLM1 mRNA表達(dá)分析(HCC和正常肝組織對比，Oncomine Meta分析)，綜合分析4個(gè)HCC研究的GOLM1 mRNA差異表達(dá)情況(癌和正常)，結(jié)果顯示GOLM1是HCC中高表達(dá)基因；B：TCGA轉(zhuǎn)錄

組測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果，GOLM1 mRNA在HCC中明顯高于正常組織，并和總生存期相關(guān)(K-M分析)

Fig1GOLM1mRNAexpressioninHCCbyonlineanalysis

表1 GOLM1 mRNA表達(dá)水平與HCC患者病理臨床特征相關(guān)性分析(TCGA數(shù)據(jù)) Tab 1 Correlation analysis between GOLM1 mRNA expression and clinicopathological characteristics of HCC (TCGA data)

注：#代表三個(gè)種族組間ANOVA分析，其他為兩組間t檢驗(yàn)。

Oncomine數(shù)據(jù)分析顯示，GOLM1 mRNA表達(dá)在肝硬化(上)和不典型增生病變(下)中的表達(dá)均高于正常肝組織(見圖2)。

2.2基因芯片檢測GOLM1蛋白在HCC組織中的表達(dá)GOLM1陽性信號定位于HCC細(xì)胞的核周區(qū)或細(xì)胞質(zhì)中，癌旁組織中的非腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中呈彌散細(xì)顆粒狀(見圖3)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GOLM1蛋白陽性率在癌組織和癌旁正常組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(71.1%vs72.2%)，其表達(dá)與病理臨床特征之間無顯著相關(guān)性(見表2)，與總生存時(shí)間、無病生存時(shí)間也無明顯關(guān)系。

2.3GOLM1相關(guān)miRNA和lncRNA生物信息學(xué)預(yù)測TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載后進(jìn)行差異基因分析，通過TargetScan在線預(yù)測GOLM1的相關(guān)miRNA后，和HCC中差異的miRNA取交集，共發(fā)現(xiàn)48個(gè)GOLM1基因相關(guān)的miRNA。通過mRNA和lncRNA共表達(dá)分析并和HCC中差異lncRNA取交集，發(fā)現(xiàn)6個(gè)差異lncRNA和GOLM1呈正相關(guān)(見圖4、表3)。

圖2 GOLM1 mRNA在肝硬化或不典型增生結(jié)節(jié)中的異常表達(dá)Fig 2 Abnormal expressions of GOLM1 mRNA in cirrhosis and dysplasia tissues of liver

圖3GOLM1蛋白在HCC組織中的表達(dá)和生存分析A：陽性染色的HCC和癌旁組織免疫組化結(jié)果(SP法，200×)，癌旁組織染色為彌漫性，HCC組織著色多為粗顆粒狀；B：GOLM1蛋白表達(dá)和HCC患者總生存時(shí)間(OS)、無復(fù)發(fā)生存時(shí)間(DFS)相關(guān)性分析

Fig3GOLM1proteinexpressioninHCCandsurvivalanalysis

表2 GOLM1蛋白表達(dá)和HCC患者病理臨床特征之間的相關(guān)性分析(組織芯片)Tab 2 Correlation analysis between expression of GOLM1 protein and clinicopathological features of HCC (tissue microarray)

注：cor：相關(guān)系數(shù)。

圖4TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析在HCC中GOLM1mRNA相關(guān)的miRNA和lncRNAA：通過TargetScan預(yù)測GOLM1相關(guān)的miRNA(藍(lán))，和HCC中差異的miRNA(黃)用Venn圖取交集，共得到48個(gè)miRNA；B：利用R軟件函數(shù)cor.test分析和GOLM1基因

有共表達(dá)關(guān)系的lncRNA(藍(lán))，和HCC中差異lncRNA(黃)取交集，得到6個(gè)lncRNA

3 討論

雖然在生理情況下GOLM1主要在膽管上皮細(xì)胞中表達(dá)，肝細(xì)胞中很少表達(dá)，但多種病因可導(dǎo)致GOLM1在肝臟疾病中表達(dá)異常。早期報(bào)道表明，血清GOLM1檢測可作為診斷HCC的潛在標(biāo)志物，甚至優(yōu)于AFP[2]。然而，另外一些研究表明，HCC患者和肝硬化患者血清GOLM1均可呈高水平表達(dá)，因此GOLM1在HCC診斷中的可靠性受到質(zhì)疑[3-5]。根據(jù)SHAN等[8]研究，GOLM1蛋白在HCC組織中表達(dá)最高，從高度不典型增生、慢性乙型肝炎到正常肝細(xì)胞逐漸降低(IHC和Western blotting)，但高級別不典型增生與HCC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，該研究在血清的檢測結(jié)果中顯示，肝硬化患者血清GOLM1最高。提示GOLM1蛋白作為肝良惡性疾病鑒別診斷的指標(biāo)尚缺乏足夠的證據(jù)支持。因此，進(jìn)一步評價(jià)GOLM1對HCC的診斷價(jià)值具有重要意義。

為了進(jìn)一步研究GOLM1是否可以作為HCC的特異性診斷標(biāo)志物，并分析其預(yù)后價(jià)值，Oncomine在線工具可進(jìn)行多個(gè)研究的Meta分析功能，本研究利用該數(shù)據(jù)庫的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行在線分析，發(fā)現(xiàn)HCC組織中GOLM1 mRNA表達(dá)高于正常組織，肝硬化、不典型增生組織中的表達(dá)量也高于正常組織，由于在線數(shù)據(jù)分析功能所限，所以這些結(jié)果不能同時(shí)顯示HCC、肝硬化、不典型增生、正常之間的比較結(jié)果。TCGA數(shù)據(jù)庫mRNA測序結(jié)果也顯示，GOLM1 mRNA在HCC中高表達(dá)，并與HCC患者的總生存時(shí)間相關(guān)。然而，我們的組織芯片結(jié)果顯示，其蛋白水平變化在HCC與癌旁正常組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這些結(jié)果提示，癌組織GOLM1 mRNA水平變化可能比蛋白檢測更適合于作為HCC的診斷標(biāo)志物。

GOLM1 mRNA可能與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為了更深入地了解GOLM1基因的調(diào)控，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析，分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中mRNA、miRNA和lncRNA之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了48個(gè)可能調(diào)控GOLM1表達(dá)的miRNA，及6個(gè)與GOLM1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)的lncRNA。lncRNA是近幾年發(fā)現(xiàn)的具有重要調(diào)控功能的非編碼RNA，其作用機(jī)制復(fù)雜，哺乳動(dòng)物已發(fā)現(xiàn)的lncRNA數(shù)量多達(dá)10萬條以上，很多l(xiāng)ncRNA目前也僅僅知道其核苷酸序列，本研究中這6個(gè)lncRNA，多數(shù)功能還不明確，也無與GOLM1相互作用文獻(xiàn)報(bào)道。其中僅LINC00511有癌基因的作用，分別在肺癌中通過EZH2/P57信號通路、在膀胱癌中通過Wnt/β-cantenin信號通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。

miRNA的功能研究相對較多，大多數(shù)miRNA和mRNA結(jié)合，誘導(dǎo)后者的降解，從而導(dǎo)致其功能抑制，但最近研究發(fā)現(xiàn)，胞核中的miRNA也具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄功能。本文預(yù)測的GOLM1相關(guān)的miRNA中，一些已在肝癌中報(bào)道，其中以miR-200家族研究最多[12-14]，多數(shù)具有抑癌基因作用，如miR-200c-5p可通過MAD2L1基因抑制HCC的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。另外，在肺腺癌中，miR-200a可抑制GOLM1，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[16]。本研究預(yù)測的這些miRNA對GOLM1的調(diào)控機(jī)制還需要更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。