曾婉嘉 于廣鑫 魯鳳民

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球癌癥相關(guān)死亡率的第三大原因，其主要危險(xiǎn)因素包括慢性病毒性肝炎、酗酒及非酒精性脂肪性肝病等。HCC死亡率高的主要原因之一是早期檢出率低，大部分患者在確診時(shí)已處于疾病進(jìn)展期，可選治療方式少，預(yù)后不佳。肝臟超聲(US)是最廣泛用于肝癌早期篩查的影像學(xué)檢查，相對于MRI和CT而言，US具有操作難度小、花費(fèi)較低的優(yōu)勢，但其靈敏度也相對較低。臨床上常將血清甲胎蛋白(AFP)水平用作US的輔助手段，可以在不顯著降低特異性的前提下，提高監(jiān)測的靈敏度。除了AFP以外，AFP異質(zhì)體(AFP-L3%)和異常凝血酶原(DCP)等也在早期HCC篩查和診斷中表現(xiàn)出了較好的應(yīng)用前景[1]。

近年來，“液體活檢”這一新的非侵入性的診斷概念受到了越來越多的關(guān)注，其針對循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、游離微小RNAs(microRNAs, miRs)和細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)等進(jìn)行檢測，以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷。例如可通過循環(huán)腫瘤DNA來檢測癌細(xì)胞的單核苷酸多態(tài)性、染色體拷貝數(shù)變異及甲基化變化等[2]。而包括外泌體在內(nèi)的EVs因富含大量的miRs、DNA碎片和蛋白質(zhì)等信息，具有作為生物標(biāo)志物的巨大潛力。

一、EVs的形成機(jī)制、純化及檢測

EVs是活細(xì)胞分泌的、由脂質(zhì)雙層膜包裹的囊泡，根據(jù)其生物學(xué)方式分為三類：外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體由多囊泡體與質(zhì)膜融合，將管腔內(nèi)囊泡釋放至細(xì)胞外而形成，直徑30～150 nm之間，富含CD81、CD63和CD9等標(biāo)記物；微泡由質(zhì)膜出芽直接形成，直徑在50～1 000 nm 之間；凋亡小體由細(xì)胞凋亡過程中等離子體膜起泡或細(xì)胞破碎形成，直徑一般超過500 nm[3]。不同種類的囊泡在大小上有一定的重疊，所以需要依靠其生物發(fā)生以及釋放到細(xì)胞外環(huán)境的方式進(jìn)行區(qū)分。

目前EV純化方式有很多種，如根據(jù)要獲得的囊泡的大小和密度，利用轉(zhuǎn)速分離的差速離心法；基于一定的離心力下將EVs分配到密度梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶進(jìn)行分離的密度梯度離心法；基于EV大小不同進(jìn)行分離的大小排阻色譜法以及根據(jù)不同EV表面標(biāo)志物的差異進(jìn)行分離的磁珠免疫親和法等。不同技術(shù)在靈敏性、特異度和操作復(fù)雜度上各有優(yōu)缺點(diǎn)。對于EV顆粒大小的檢測，常用的技術(shù)有透射電子顯微鏡、動態(tài)光散射分析、納米粒子跟蹤分析(NTA)和流式細(xì)胞術(shù)(FC)，其中NTA和FC不僅可以檢測EV顆粒的大小，還可以計(jì)算EV顆粒的濃度。在對囊泡內(nèi)容物的檢測方面，EV內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA的種類及含量常用于疾病的監(jiān)測，可以通過ELISA、Western-blot、質(zhì)譜等方法檢測蛋白，利用RT-qPCR、mRNA-seq和miRNA-seq測量RNA[4]。

二、EVs在HCC診斷及預(yù)后判斷中的應(yīng)用

EVs在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要作用，參與了很多生理及病理進(jìn)程，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。一方面，抗原呈遞細(xì)胞可通過攝取腫瘤細(xì)胞衍生的EVs所攜帶的抗原，激活CD8陽性T細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤活性；另一方面，腫瘤細(xì)胞分泌的EVs中含有多種免疫調(diào)節(jié)因子，可以誘導(dǎo)局部微環(huán)境的免疫抑制，甚至影響循環(huán)免疫細(xì)胞的功能。此外，EVs中還含有大量促增殖和血管生成的細(xì)胞因子，極大地增強(qiáng)了腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力。許多研究表明，EVs的內(nèi)容物在不同人群中存在差異，可通過測定其中的RNA、蛋白質(zhì)及DNA水平等來對正常人群、原發(fā)性及復(fù)發(fā)性HCC患者進(jìn)行鑒別[3]。不僅如此，EVs的內(nèi)容物有外層脂質(zhì)膜的保護(hù)，能夠穩(wěn)定地存在于循環(huán)血及體液中，其分離方式對患者的創(chuàng)傷小，可作為HCC診斷及預(yù)后判斷的潛在標(biāo)志物。

(一)RNAs 外泌體中有豐富的miRNAs，且與HCC及其復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Sugimachi等[5]對HCC患者血清外泌體中miRs的表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)患者術(shù)前血清外泌體miR-718水平顯著低于無復(fù)發(fā)患者，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-718下調(diào)可導(dǎo)致HOXB8水平上升，促進(jìn)HCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。分析患者血清外泌體功能性miRs的水平，不僅可以對HCC患者進(jìn)行診斷，還可預(yù)測其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，有利于治療方案的選取。

長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)也參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可作為HCC診斷的生物標(biāo)志物。研究表明，HCC患者血清外泌體中的ENSG00000258332.1和LINC00635水平顯著高于慢性乙型肝炎和肝硬化患者，且與門靜脈腫瘤栓塞、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及總生存期相關(guān)。此外，將這兩種lncRNAs與AFP聯(lián)用可提高HCC診斷及預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性[6]。

(二)蛋白質(zhì) 外泌體攜帶的蛋白質(zhì)同樣在HCC發(fā)展中起到重要作用。實(shí)驗(yàn)表明，貼壁生長的HCC細(xì)胞衍生的外泌體中含有SMAD家族成員3(SMAD3)蛋白，有助于HCC細(xì)胞的黏附。外泌體中SMAD3蛋白的豐度與HCC的分期、病理分級和術(shù)后患者的無病生存率都有很高的相關(guān)性[7]。除可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移的SMAD3蛋白外，HCC細(xì)胞衍生外泌體中的多種鈣結(jié)合蛋白、糖代謝調(diào)節(jié)蛋白等表達(dá)水平都與正常組織有顯著差異，這使得外泌體中的蛋白質(zhì)有著輔助診斷HCC及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的潛力[8]。

(三)DNA 目前多數(shù)研究都集中在外泌體中的RNAs和蛋白質(zhì)在HCC診斷方面的應(yīng)用，關(guān)于HCC細(xì)胞釋放的外泌體中DNA的功能及診斷價(jià)值尚缺乏詳細(xì)報(bào)道。最新的研究表明，HCC患者血清中游離HBV DNA整合片段可用于腫瘤檢測及術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。研究者檢測了50例HBV相關(guān)HCC患者術(shù)前及術(shù)后兩個(gè)月的血清樣本中的病毒-宿主嵌合DNA片段，結(jié)果顯示，88%的HBV相關(guān)HCC患者血清中能檢測到病毒整合片段，且絕大部分患者血清中的病毒-宿主嵌合DNA拷貝數(shù)與腫瘤大小存在相關(guān)性[9]。值得注意的是，對比術(shù)前及術(shù)后整合片段的序列，26.2%的患者術(shù)后血清樣本中的病毒-宿主嵌合DNA特征與基線時(shí)一致，而這些患者中有81.8%在1年之內(nèi)就出現(xiàn)了HCC復(fù)發(fā)，這些結(jié)果提示，病毒-宿主嵌合DNA可用于HBV相關(guān)HCC的檢測及預(yù)后判斷，同時(shí)它還可與AFP聯(lián)用以獲得更好的診斷和預(yù)測價(jià)值。此前我們的研究也顯示，絕大部分復(fù)發(fā)性HCC的DNA甲基化模式與其原發(fā)灶極為相似；而在HBV相關(guān)HCC的原發(fā)-復(fù)發(fā)癌配對樣本中，可以檢測到幾乎完全相同的病毒-宿主嵌合DNA片段[10]。由于病毒整合片段可被釋放到外周血中，因此也存在被包裹進(jìn)EVs中的可能。雖然目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道，但EVs中的DNA比游離DNA更穩(wěn)定，且純化后容易進(jìn)行定量檢測，具備用于HCC檢測及判斷其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的潛能。

三、EVs在HCC治療中的應(yīng)用探索

除了上述在實(shí)驗(yàn)室診斷方面的應(yīng)用之外，EVs免疫原性低，生物相容性好，被認(rèn)為是良好的遞送載體，因此也有很多研究在關(guān)注其在HCC治療方面的應(yīng)用。miR-335已被報(bào)道具有腫瘤抑制作用，HCC細(xì)胞中miR-335表達(dá)水平普遍下調(diào)。有研究者利用肝星狀細(xì)胞衍生的EVs將治療性miR-335運(yùn)輸?shù)紿CC細(xì)胞內(nèi)，抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移，達(dá)到了良好的治療效果[11]。而我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，將CRISPR系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因編輯時(shí)，Cas9蛋白和gRNA均可進(jìn)入外泌體中，從而被其他細(xì)胞攝取并發(fā)揮基因編輯作用[12]。提示在體內(nèi)應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對腫瘤進(jìn)行治療時(shí)，需要考慮到外泌體中有基因編輯活性的gRNA和Cas9蛋白可能帶來的影響。

近年來越來越多的證據(jù)表明，EVs在HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中都有著重要作用，其攜帶的miRs、lncRNAs、蛋白質(zhì)及DNA片段等均可作為HCC診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物。但要將EVs實(shí)際應(yīng)用于臨床診斷還存在很多困難，如何快速且特異性地分離EVs的各種組分并對其進(jìn)行檢測還有待進(jìn)一步探究。目前關(guān)于EVs診斷效能評價(jià)的研究較少，研究隊(duì)列規(guī)模普遍偏小，還需要更大的樣本量和多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證。