阮同德 徐英民 顧傳蘭 許麗娜 王海峰 徐蒙 高敏 馬德亮

【摘要】 目的 分析微小RNA（miR）-34b及c-Myc在膀胱癌中的作用， 并驗證兩者相互作用關(guān)系。方法 107例膀胱癌患者， 全部患者均行手術(shù)治療， 取病理組織及瘤旁組織樣本， 比較miR-34b及c-Myc在膀胱癌和瘤旁組織、肌層浸潤和肌層非浸潤及的各病理分級的表達水平， 采用熒光素酶法及生物信息學軟件分析miR-34b與c-Myc的相互作用關(guān)系。結(jié)果 miR-34b在膀胱癌中的相對表達水平為（0.0213±0.0061）， 與瘤旁組織的（0.0563±0.0089）對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;c-Myc在膀胱癌中的相對表達水平為（0.484±0.063）， 與瘤旁組織的（0.216±0.045）對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miR-34b在45例肌層浸潤性膀胱癌中的相對表達水平為（0.0234±0.0026）， 與62例肌層非浸潤性膀胱癌中的（0.0496±0.0075）對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;c-Myc在45例肌層浸潤性膀胱癌中的相對表達水平為（0.5180±0.0826）， 與62例肌層非浸潤性膀胱癌中的（0.3140±0.0753）對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miR-34b在低度惡性傾向、低分級、高分級病例的表達水平依次為（0.0364±0.0047）、（0.0219±0.0034）和（0.0102±0.0028）， 其表達水平隨病理分級升高呈現(xiàn)降低趨勢， 組間對比差異有統(tǒng)計學意義（F=386.732， P<0.05）;c-Myc在低度惡性傾向、低分級、高分級病例的表達水平依次為（0.083±0.013）、（0.236±0.032）和（0.571±0.058）， 其表達水平隨病理分級升高呈現(xiàn)上升趨勢， 組間對比差異有統(tǒng)計學意義（F=106.964， P<0.05）。經(jīng)生物信息學軟件檢驗發(fā)現(xiàn)， c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 采用熒光素酶法進一步檢測后證實， 共轉(zhuǎn)染miR-34b的熒光強度（1.035±0.024）au明顯低于共轉(zhuǎn)染的c-Myc強度（3.572±0.068）au （P<0.05）。結(jié)論 c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 二者存在密切的相關(guān)性， 可通過下調(diào)c-Myc水平提升miR-34b表達， 抑制膀胱細胞癌增殖。

【關(guān)鍵詞】 微小RNA-34b;c-Myc;膀胱癌;作用

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.04.007

臨床研究證實， miR-34b在腫瘤進展中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用， 在胃癌、肝癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤組織中存在多項miRNA表達異常情況， 而膀胱癌發(fā)展與多種癌基因、抑癌基因的相互作用存在密切相關(guān)性[1-3]。目前醫(yī)學界尚未就miR-34b與c-Myc的表達及作用關(guān)系達成統(tǒng)一共識， 為了探索二者的聯(lián)系， 本文現(xiàn)就miR-34b及c-Myc在膀胱癌中的作用及驗證兩者相互作用關(guān)系展開了下述研究， 以供參考?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2014年3月～2018年3月收治的107例膀胱癌患者， 全部患者均行手術(shù)治療， 取病理組織及瘤旁組織樣本作為研究對象， 全部實驗用品均在有效期內(nèi)。

1. 2 方法 采用實時定量PCR提取樣本總RNA， 根據(jù)試劑盒操作說明將其轉(zhuǎn)錄呈cDNA模板， 利用探針法檢測器miR-34b表達， 內(nèi)參U6。采用SYBR Green法測定c-Myc表達， 上游引物序列為5'-GCATCCGCACACTCGCACGAA-3';下游引物序列為5'-CGACAGTCCATCGATCGCCTAGC-3'， 運用2-△△CT相對定量法對比基因表達。利用生物信息學軟件進行作用于c-Myc的靶向miRNA預測， 軟件包括PicTar、miRanda、TargetScan。采用熒光素酶試劑盒處理細胞組織， 利用實施熒光定量儀測定miR-34b轉(zhuǎn)染狀態(tài)。

1. 3 觀察指標 比較miR-34b及c-Myc在膀胱癌和瘤旁組織、肌層浸潤和非肌層浸潤及的各病理分級的表達水平， 分析miR-34b與c-Myc的相互作用關(guān)系。所有患者中肌層浸潤性患者45例， 肌層非浸潤性患者62例。根據(jù)WHO 2004標準[2]將107例病理切邊標本分為三組， 包括低度惡性傾向患者24例， 低分級患者48例， 高分級患者35例。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。相關(guān)性檢驗采用應用Spearman等級相關(guān)分析法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 miR-34b及c-Myc在不同組織、肌層浸潤、病理分級的表達水平對比 ①miR-34b及c-Myc在膀胱癌和瘤旁組織的表達水平：miR-34b在膀胱癌中的相對表達水平為（0.0213±0.0061）， 在瘤旁組織的表達水平為（0.0563±0.0089）， 組間對比差異有統(tǒng)計學意義（t=33.554， P=0.000<0.05）;c-Myc在膀胱癌中的相對表達水平為（0.484±0.063）， 在瘤旁組織的表達水平為（0.216±0.045）， 組間對比差異有統(tǒng)計學意義（t=35.807， P=0.030<0.05）。②肌層浸潤和非肌層浸潤中miR-34b及c-Myc的表達水平：miR-34b在45例肌層浸潤性膀胱癌中的相對表達水平為（0.0234±0.0026）， 在62例肌層非浸潤性膀胱癌中的相對表達水平為（0.0496±0.0075）， 組間對比差異有統(tǒng)計學意義（t=22.451， P=0.000）;c-Myc在45例肌層浸潤性膀胱癌中的相對表達水平為（0.5180±0.0826）， 在62例肌層非浸潤性膀胱癌中的相對表達水平為（0.3140±0.0753）， 組間對比差異有統(tǒng)計學意義（t=13.280， P=0.000<0.05）。③不同病理分級下miR-34b及c-Myc表達水平的變化情況：miR-34b在低度惡性傾向、低分級、高分級患者中的表達水平依次為（0.0364±0.0047）、（0.0219±0.0034）和（0.0102±0.0028）， 其表達水平隨病理分級升高呈現(xiàn)降低趨勢， 組間對比差異有統(tǒng)計學意義（F=386.732， P<0.05）;c-Myc在低度惡性傾向、低分級、高分級患者中的表達水平依次為（0.083±0.013）、（0.236±0.032）和（0.571±0.058）， 其表達水平隨病理分級升高呈現(xiàn)上升趨勢， 組間對比差異有統(tǒng)計學意義（F=106.964， P<0.05）。

2. 2 miR-34b與c-Myc的相互作用關(guān)系 經(jīng)生物信息學軟件檢驗發(fā)現(xiàn)， c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 采用熒光素酶法進一步檢測后證實， 共轉(zhuǎn)染miR-34b的熒光強度（1.035±0.024）au明顯低于共轉(zhuǎn)染的c-Myc強度（3.572±0.068）au（P<0.05）， miR-34b可對c-Myc產(chǎn)生直接作用。

3 討論

國內(nèi)外相關(guān)報道顯示， miR-34b及c-Myc表達水平與腫瘤病理分級、腫瘤分類密切相關(guān)， 大量研究資料顯示， 膀胱癌組織細胞中c-Myc呈現(xiàn)活化狀態(tài)， 且隨腫瘤病理分級的升高、病情的加劇呈現(xiàn)升高態(tài)勢。本研究證實， c-Myc在膀胱癌的表達水平明顯高于瘤旁組織， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。經(jīng)過深入探討miR-34b及c-Myc在膀胱癌中的作用后發(fā)現(xiàn)， miR-34b在肌層浸潤性膀胱癌中的表達水平為明顯低于肌層非浸潤性膀胱癌組織， 而c-Myc在肌層浸潤性膀胱癌中的表達水平為明顯高于肌層非浸潤性膀胱癌組織， 這與既往研究一致。

整理相關(guān)文獻資料后可知， c-Myc在腫瘤細胞分化、生長、增殖及凋亡過程中發(fā)揮著重要作用， 與腫瘤生物學行為存在緊密聯(lián)系。本組實踐證實， 膀胱癌組織細胞的miR-34b的表達水平隨病理分級升高呈現(xiàn)降低趨勢， c-Myc的表達水平隨病理分級升高呈現(xiàn)上升趨勢， 提示c-Myc與膀胱癌惡性程度關(guān)聯(lián)密切。經(jīng)過生物信息學軟件預測、熒光素酶檢驗后證實， c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 共轉(zhuǎn)染miR-34b的熒光強度明顯低于共轉(zhuǎn)染的c-Myc強度， 表明可通過下調(diào)c-Myc水平影響癌細胞生物行為， 防控病情進展。

綜上所述， c-Myc是miR-34b的直接靶基因， 通過下調(diào)c-Myc表達可促使miR-34b表達得到有效提升， 加快癌細胞凋敝， 抑制癌細胞增殖， 對膀胱癌的臨床診療具有重要的參考價值。

參考文獻

[1] 柳清， 尤泊森， 馬景光， 等. MicroRNA-30a在膀胱癌中的表達及作用. 實用腫瘤學雜志， 2017（4）：310-315.

[2] 郭敏， 劉佩， 鄭國華， 等. p53/miR-34a通路介導羽扇豆醇的抑制人膀胱癌T24細胞增殖作用. 中國藥師， 2016， 19（9）：1629-1632.

[3] 萬鵬飛， 黃亞琴， 王志， 等. 穩(wěn)定高表達miR-449c的5637膀胱癌細胞株的建立. 細胞與分子免疫學雜志， 2016， 32（6）：760-763.

[收稿日期：2018-08-14]