陳紅爽，張孟陽(yáng)，王麗娟，畢付提，王德培

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

色素即著色劑，是印染工業(yè)和食品添加劑的一個(gè)重要組成部分，它可以改善印染物品和食品的色澤，是決定產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[1]。目前色素主要來(lái)源：化學(xué)合成色素和天然色素。許多合成色素經(jīng)毒理檢測(cè)證實(shí)對(duì)人體有一定的危害性，因而被限制使用。天然色素則因安全性高并具有一定的保健功能而受到廣泛關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)[2]。國(guó)內(nèi)對(duì)天然紅色素的提取研究起步較晚，但發(fā)展迅速[3]。目前天然色素遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足現(xiàn)代工業(yè)的需要，開(kāi)發(fā)天然色素新品種，對(duì)原有天然色素的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改造，己成為非常迫切的問(wèn)題[4-5]。因此通過(guò)誘變育種或是分子手段選育出一株高產(chǎn)紅色素的菌株具有重要意義。

常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）是近幾年新發(fā)展的一種誘變方法[6]。它是一種等離子體源，能夠產(chǎn)生25℃～40℃的溫度且具有高活性粒子濃度的等離子體射流。這種高活性的離子體能夠使微生物的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及通透性發(fā)生改變，也能與生物體內(nèi)的生物大分子（酶或DNA）相互作用，引起生物體的死亡或突變[7]，從而引起基因的隨機(jī)突變。誘變后突變株的細(xì)胞膜具有高通透性的特點(diǎn)，底物可以通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)物同時(shí)也能很快分泌到細(xì)胞外[8]。與分子手段相比，等離子體誘變育種具有操作簡(jiǎn)便、安全無(wú)毒、低成本的優(yōu)點(diǎn)[9]。多功能等離子體誘變系統(tǒng)（multifunction plasma mutagenesis system，MPMS）作為一種新一代微生物誘變平臺(tái)，以等離子體誘變?yōu)橹?，可與紫外、化學(xué)誘變等多種手段結(jié)合，提高了突變率和改變了突變類(lèi)型[10]。

本文以前期從自然界中分離篩選得到的野生赤紅球菌YM-2作為出發(fā)菌株，采用等離子體單獨(dú)誘變，等離子體連續(xù)誘變、紫外線(xiàn)單獨(dú)誘變、紫外線(xiàn)等離子體復(fù)合誘變等方法對(duì)赤紅球菌YM-2進(jìn)行誘變，通過(guò)對(duì)不同誘變方法及其條件的探究，以期篩選育出一株高產(chǎn)紅色素的赤紅球菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

赤紅球菌YM-2（Rhodococcus ruber YM-2）由生化過(guò)程與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室自潛水艇煙囪中分離得到，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)：CGMCC No.12604。

1.1.2 試劑

果糖、氯化鈉、MgSO4·7H2O、KH2PO4（分析純）：博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂、玉米漿、無(wú)水乙醇（分析純）：天津市化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：果糖10 g/L，蛋白胨6 g/L，酵母粉15 g/L，氯化鈉 10 g/L，玉米漿 15 g/L，KH2PO40.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L；pH 6.5；滅菌121℃，20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：果糖15 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉15 g/L，氯化鈉 12 g/L，玉米漿 17 g/L，KH2PO40.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L ；pH 6.5；滅菌 121 ℃，20 min。

篩選培養(yǎng)基：果糖8 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉6 g/L，玉米漿10 g/L，KH2PO40.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L ；pH 6.5；滅菌 121℃，20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Mandela型多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS）：北京艾德豪克儀器生物有限公司；常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（ARTP）：北京思清源生物科技有限公司；320-S型pH計(jì)：梅特勒-托利多（上海有限公司）；TU-1810紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；MQD-S3R旻泉搖床：上海旻泉儀器有限公司；KM-23C超聲波清洗機(jī)：廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；YP電子天平：上海津平科學(xué)儀器有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取一環(huán)斜面或平板中菌落直徑大且顏色分布均勻的單菌落，接種到含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中150 r/min，28℃培養(yǎng)40 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將活化好的種子液，以4%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中190 r/min，28℃發(fā)酵72 h。

誘變前菌體活化培養(yǎng)：取活化好的種子液，以4%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種到含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中190 r/min，28℃培養(yǎng)24 h，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中后期。

1.3.2 菌株的誘變

菌懸液的制備：取1 mL活化的菌液于2 mL EP管內(nèi)，4 000 r/min離心3 min，棄上清收集菌體，用無(wú)菌的生理鹽水離心洗滌3次，然后將菌體重懸于無(wú)菌生理鹽水中，稀釋10倍，使細(xì)胞的終濃度為1×107個(gè)/mL。

等離子體誘變：取菌懸液10 μL滴在ARTP誘變專(zhuān)用無(wú)菌小鐵片中央，將其置于等離子體誘變系統(tǒng)（ARTP）中進(jìn)行等離子體誘變，以99%的氦氣作為工作氣體，輸入功率120W，間距15mm，氣流量10 L/min，分別誘變時(shí)長(zhǎng) 10、15、20、25、30、35、40、45、50 s計(jì)算致死率及正突變率[11]。

等離子體連續(xù)誘變：將第1次等離子誘變篩選出的菌株45 S-2，作為出發(fā)菌株制備成菌懸液，經(jīng)等離子誘變的流程和條件，進(jìn)行第2次等離子誘變，篩選高產(chǎn)紅色素菌株。

紫外線(xiàn)誘變：取上述菌懸液10 μL均勻的涂布于誘變杯中，晾干后將其置于多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS），用紫外線(xiàn)誘變進(jìn)行處理，分別誘變時(shí)長(zhǎng)20、25、30、35、40、45、50、55、60 s，計(jì)算致死率及正突變率。

紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變：取上述菌懸液10 μL均勻的涂布于誘變杯中，晾干后將其置于多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS），先用紫外線(xiàn)誘變進(jìn)行處理，隨后進(jìn)行等離子體誘變，計(jì)算致死率及正突變率。

1.3.3 篩選方法

誘變初篩：將誘變處理后的誘變小鐵片加入裝有990 μL培養(yǎng)基的2 mLEP管里，將菌種洗下制成菌懸液。稀釋100倍后，取200 μL均勻涂到篩選培養(yǎng)基表面，28℃靜置培養(yǎng)72 h，挑選菌落直徑≥1 mm的菌株。

誘變復(fù)篩：將初篩菌種接于液體種子培養(yǎng)基中，于搖床中150 r/min，28℃培養(yǎng)40 h，活化2次后以4%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖床中190 r/min，28℃培養(yǎng)72 h，然后將菌液收集到離心管中5 000 r/min離心10 min，棄上清液留菌體，用蒸餾水離心洗滌3次。將濕菌體于-20℃冰箱里冷凍12 h。

1.3.4 紅色素的提取及檢測(cè)方法

取出冷凍12h后的濕菌體解凍30min，加入100%乙醇10 mL混勻，在冰浴上進(jìn)行超聲波碎處理，超聲功率300 w，萃取菌體內(nèi)紅色素，用分光光度計(jì)對(duì)萃取的紅色素進(jìn)行光譜掃描，測(cè)出紅色素的OD450值。

1.3.5 計(jì)算

致死率的計(jì)算：對(duì)誘變處理過(guò)的菌液在適當(dāng)?shù)南♂尪认峦科桨澹?8℃培養(yǎng)72 h通過(guò)單菌落計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算其致死率，并獲得致死率曲線(xiàn)。

正突變率的計(jì)算：28℃培養(yǎng)72 h挑取平板上菌落直徑≥1 mm的菌株，菌落顏色紅色程度深且均勻的菌株統(tǒng)計(jì)為正突變株。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩方法的建立

所用的菌株是赤紅球菌YM-2，其次生代謝產(chǎn)物紅色素，肉眼可見(jiàn)。出發(fā)菌株YM-2在篩選培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)72 h菌落直徑分布見(jiàn)表1。

由表1可知，菌落直徑≥1mm的占7.0%，0.74mm～1 mm的菌落占11.0%，菌落直徑≤0.74 mm的菌落占82.0%。

試驗(yàn)選擇赤紅球菌在篩選培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)72 h挑選菌落直徑≥1 mm，菌落呈均勻深紅色菌株，作為初篩正突變菌株。

表1 平板菌落大小分布Table 1 The distribution of colony size

2.2 復(fù)篩方法的建立

紅色素是赤紅球菌次生代謝的產(chǎn)物，因此，與赤紅球菌發(fā)酵時(shí)間和菌體密度密切相關(guān)，將赤紅球菌搖瓶發(fā)酵連續(xù)5 d，每隔一段時(shí)間取樣一次，測(cè)其菌體干重和紅色素產(chǎn)量，繪制菌體干重和紅色素含量隨發(fā)酵時(shí)間變化的積累曲線(xiàn)，測(cè)出提取紅色素的時(shí)間。赤紅球菌YM-2的菌體干重及類(lèi)胡蘿卜素積累曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 赤紅球菌YM-2的菌體干重及類(lèi)胡蘿卜素積累曲線(xiàn)Fig.1 The profile of bacterial weight and carotenoid accumulation of YM-2

由圖1可以看出，菌體的生長(zhǎng)和紅色素的合成主要分為3個(gè)階段。在0～36 h為菌體生長(zhǎng)階段菌體大量增殖，但是紅色素只有少量合成；在36 h～72 h為紅色素合成階段，在此階段內(nèi)生物量基本保持不變，紅色素開(kāi)始大量積累[12]；在搖瓶發(fā)酵進(jìn)行72 h之后，菌體生物量和總類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量都開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的下降，因此將此時(shí)間段稱(chēng)為產(chǎn)物降解階段。因此將搖瓶復(fù)篩發(fā)酵時(shí)間確定為72 h，此時(shí)菌體生物量和總類(lèi)胡蘿卜素的粗提產(chǎn)量分別達(dá)到8.25。

2.3 等離子體誘變結(jié)果

2.3.1 等離子體誘變對(duì)菌株致死率及正突變率的影響

菌株經(jīng)等離子誘變后，其致死率和正突變率如圖2所示。

圖2 等離子誘變對(duì)菌株的致死率和正突變率影響Fig.2 The effect of ARTP treatment on lethality rate and positive mutation rate

等離子體誘變對(duì)YM-2的致死力較強(qiáng)，ARTP處理25 s時(shí)致死率達(dá)到81.05%，處理50 s時(shí)致死率達(dá)到92.1%。已有研究表明，致死率通常在85%～95%之間的正突變率最高，所以一般選擇這個(gè)致死率區(qū)間進(jìn)行誘變篩選[13-14]。通過(guò)對(duì)致死率在80%～95%之間的6個(gè)點(diǎn)測(cè)定其正突變率，如圖2顯示，結(jié)果表明等離子體處理45 s時(shí)正突變率最高，為39.40%，此時(shí)致死率為88%。

2.3.2 等離子體單獨(dú)誘變的篩選結(jié)果

按照2.1的方法對(duì)等離子體處理后的菌懸液，進(jìn)行平板初篩，挑取30株菌落直徑較大菌株按照2.2的方法進(jìn)行復(fù)篩，紅色素產(chǎn)量見(jiàn)圖3所示。

圖3 等離子誘變突變株紅色素的產(chǎn)量Fig.3 The red pigment production of the mutants on ARTP treatment

由圖3可知，直徑≥1 mm的菌株中，90%的菌株發(fā)生了正突變，證明了初篩方法的有效性。從中篩選出一株紅色素產(chǎn)量最高菌45S-2，紅色素提取液的OD450值為3.120，相比于出發(fā)菌株提高了16.0%。

2.4 等離子體連續(xù)誘變的篩選結(jié)果

將上述等離子體誘變篩選到的高產(chǎn)菌株45S-2再次進(jìn)行等離子體誘變，按照2.1的方法進(jìn)行平板初篩，挑取30株按照2.2的方法進(jìn)行復(fù)篩，紅色素產(chǎn)量見(jiàn)圖4所示。

圖4 等離子體誘變突變株紅色素的產(chǎn)量Fig.4 The red pigment production of the mutants on ARTP treatment

由圖4可知，上圖中編號(hào)的10、18、22分別對(duì)應(yīng)菌株A2、A5、A7，這3株是篩選出產(chǎn)紅色素相對(duì)較高的菌株，紅色素提取液的OD450值依次為3.490、3.453、3.414，較出發(fā)菌分別提高了29.80%、28.36%、26.91%。

2.5 紫外誘變結(jié)果

2.5.1 紫外線(xiàn)誘變對(duì)菌株致死率及正突變率的影響

以YM-2為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變。測(cè)定其致死率曲線(xiàn)見(jiàn)圖5所示。

圖5 紫外線(xiàn)誘變對(duì)菌株的致死率和正突變率影響Fig.5 The effect of UV treatment on lethality rate and positive mutation rate

由圖5可知，紫外線(xiàn)單獨(dú)誘變對(duì)YM-2的致死力較弱，UV處理20 s時(shí)致死率達(dá)到63.04%，處理50 s時(shí)致死率達(dá)到88.7%。當(dāng)紫外線(xiàn)誘變處理40 s時(shí)正突變率最高，為23.4%，此時(shí)致死率為79.57%。

2.5.2 紫外線(xiàn)誘變的篩選結(jié)果

當(dāng)紫外線(xiàn)處理后的菌懸液，按照2.1的方法進(jìn)行平板初篩，挑取30株按照2.2的方法進(jìn)行復(fù)篩，紅色素產(chǎn)量見(jiàn)圖6所示。

圖6 紫外誘變突變株紅色素的產(chǎn)量Fig.6 The red pigment production of the mutants on UV treatment

由圖6可知，直徑≥1 mm的菌株中，80%的菌株發(fā)生了正突變，證明初篩方法的有效性。挑選的30株菌株中，紅色素提取液的OD450值為3.00～3.20的菌株占26.7%。經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)單獨(dú)誘變及篩選，圖中編號(hào)的12、8分別對(duì)應(yīng)菌株C6、C9，這兩株是篩選出產(chǎn)紅色素相對(duì)較高的菌株，紅色素提取液的OD450值依次為3.181、3.132，較出發(fā)菌分別提高了18.70%、16.87%。從試驗(yàn)結(jié)果看出紫外線(xiàn)誘變最好正突變率為23.4%，而等離子體誘變最好正突變率39.40%，所以考慮紫外線(xiàn)和等離子體復(fù)合誘變以期篩選到較好的菌株。

2.6 紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變結(jié)果

2.6.1 紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變對(duì)菌株致死率和正突變率的影響

復(fù)合誘變包括兩種或多種誘變劑的先后使用、同時(shí)使用、同一誘變劑的重復(fù)使用。普遍認(rèn)為復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)。單一誘變因子長(zhǎng)期使用容易使菌株產(chǎn)生耐受性，兩種或兩種以上誘變劑合理搭配進(jìn)行復(fù)合誘變較單一誘變效果更好[15]。

本試驗(yàn)采用先紫外處理后等離子體的復(fù)合誘變順序，以紫外線(xiàn)誘變時(shí)間20 s為確定誘變時(shí)間，等離子體誘變時(shí)長(zhǎng)分別為 4、6、8、10、12、14、16、18 s 考察致死率及正突變率如圖7所示。由圖7可知，在復(fù)合誘變中，隨著復(fù)合誘變時(shí)間的增加，致死率除在等離子體誘變10 s和12 s時(shí)有所下降，整體是呈現(xiàn)上升狀態(tài)，但正突變率卻在等離子誘變12 s時(shí)最高，說(shuō)明兩種誘變因子存在協(xié)同作用，即紫外線(xiàn)和等離子體兩種誘變方法同時(shí)作用于菌株，導(dǎo)致等離子體誘變18 s致死率到達(dá)90%以上，而單獨(dú)等離子誘變50 s時(shí)致死率達(dá)到92.1%，兩種誘變劑復(fù)合使用致死效率明顯提高。

2.6.2 紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變的篩選結(jié)果

圖7 紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變對(duì)菌株的致死率和正突變率影響Fig.7 The effect of MPMS-UV treatment onlethality rate and positive mutation rate

當(dāng)紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變處理后的菌懸液，按照2.1的方法進(jìn)行平板初篩，挑取30株按照2.2的方法進(jìn)行復(fù)篩，紅色素產(chǎn)量見(jiàn)圖8所示。

圖8 紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變突變株紅色素的產(chǎn)量Fig.8 The red pigment production of the mutants on MPMS-UV treatment

挑選的30株菌株中，紅色素提取液的OD450值為3.00～3.30的菌株占33.4%。而單獨(dú)紫外誘變復(fù)篩OD450值為3.00～3.30的菌株占26.7%，且經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變及篩選，圖中編號(hào)的21、30分別對(duì)應(yīng)菌株H5、H8，這兩株是篩選出產(chǎn)紅色素相對(duì)較高的菌株，紅色素提取液的OD450值依次為3.230、3.153，較出發(fā)菌分別提高了20.52%、17.65%，表明紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變明顯優(yōu)于紫外線(xiàn)單獨(dú)誘變。

2.7 突變菌的遺傳穩(wěn)定性研究

將經(jīng)等離子體單獨(dú)誘變、等離子體連續(xù)誘變、紫外線(xiàn)單獨(dú)誘變、紫外線(xiàn)等離子體復(fù)合誘變篩選到的菌株進(jìn)一步搖瓶復(fù)篩，得到兩株產(chǎn)量提高菌（A2、A5），為考察突變株的遺傳穩(wěn)定性，將A2、A5菌株在平板培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)10代，并將各代菌體分別經(jīng)種子活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)72 h，通過(guò)分光光度法測(cè)定紅色素產(chǎn)量，如圖9所示。

圖9 突變株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.9 Genetic stability experiment of the mutant strains

由圖9可知，菌株A2在傳代從第1代到第4代紅色素提取液的OD450值有明顯的下降，但到第5代至之后，紅色素提取液的OD450值趨于穩(wěn)定。而菌株A5在傳代從第1代到第2代紅色素提取液的OD450值略由上升趨勢(shì)，但第3代到第4代有明顯的下降，到第5代之后很快提取液的OD450值回復(fù)且遺傳比較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

該文研究等離子體誘變對(duì)赤紅球菌的致死率及正突變率的影響，從結(jié)果得出，等離子體誘變45 s時(shí)正突變率最高達(dá)到為39.40%，從誘變效果來(lái)看，有明顯的提高，可以作為誘變育種的首選方法。在該條件下再次進(jìn)行等離子體誘變，篩選出一株產(chǎn)量提高的菌株A2。與出發(fā)菌株YM-2相比，紅色素的粗提產(chǎn)量從0.86 g/L提高到1.12 g/L，提高了30.23%，傳代10次發(fā)現(xiàn)遺傳穩(wěn)定性良好。

通過(guò)不同誘變方法（等離子體單獨(dú)誘變，等離子體連續(xù)誘變，紫外線(xiàn)單獨(dú)誘變，紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變）對(duì)目的菌株YM-2進(jìn)行誘變。等離子體單獨(dú)誘變結(jié)果：篩選出45S-2，紅色素提取液的OD450值為3.120，相比于出發(fā)菌株提高了16.0%；等離子體連續(xù)誘變結(jié)果：分別篩選出A2、A5、A7，紅色素提取液的OD450值依次為 3.490、3.453、3.414，較出發(fā)菌分別提高了29.80%、28.36%、26.91%；紫外線(xiàn)單獨(dú)誘變結(jié)果：分別篩選出C6、C9，紅色素提取液的OD450值依次為3.181、3.132，較出發(fā)菌分別提高了18.70%、16.87%；紫外線(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變結(jié)果：分別篩選出H5、H8，紅色素提取液的OD450值依次為3.230、3.153，較出發(fā)菌分別提高了20.52%、17.65%。從誘變劑對(duì)菌株產(chǎn)紅色素的誘變效果可見(jiàn)：?jiǎn)为?dú)進(jìn)行紫外線(xiàn)或等離子體誘變的效果相近；而復(fù)合誘變?nèi)缱贤饩€(xiàn)-等離子體復(fù)合誘變，或等離子體連續(xù)誘變明顯比單一誘變效果提高，其中等離子體連續(xù)誘變效果對(duì)產(chǎn)紅色素有較好作用。