王燕超，馬曉燕，孫筱放，冼嘉嘉，李少英，何文智，王曉蔓，黎青

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Y染色體微缺失人群中Y-STR等位基因缺失模式分析

王燕超，馬曉燕，孫筱放，冼嘉嘉，李少英，何文智，王曉蔓，黎青

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所實(shí)驗(yàn)部，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510150

Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(Y-short tandem repeats, Y-STRs)已被廣泛應(yīng)用到DNA檢驗(yàn)領(lǐng)域。然而，由于Y染色體存在較高的結(jié)構(gòu)突變率，可能會(huì)導(dǎo)致部分Y-STR等位基因丟失甚至產(chǎn)生特殊的缺失模式，從而影響其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。位于Y染色體長臂的無精子癥因子(azoospermia factor,)與精子發(fā)生有關(guān)，該區(qū)域微缺失可導(dǎo)致不育癥。然而Y染色體微缺失人群是否存在特殊的Y-STR缺失模式仍有待研究。本文利用法醫(yī)學(xué)上常用17個(gè)Y-STR探討了85例Y染色體微缺失患者的Y-STR缺失模式。結(jié)果顯示，單純區(qū)缺失樣本，均存在基因座無效擴(kuò)增情況；單純區(qū)或單純區(qū)缺失樣本存在基因座無效擴(kuò)增；復(fù)合區(qū)缺失樣本存在基因座無效擴(kuò)增；復(fù)合區(qū)缺失樣本存在基因座無效擴(kuò)增。因此，本研究結(jié)果提示Y-STR缺失模式與Y染色體微缺失有對(duì)應(yīng)關(guān)系。

Y染色體微缺失；缺失；Y-STR等位基因缺失；不育癥

人類Y染色體第二代遺傳標(biāo)記——Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(Y chromosomal short tandem repeats, Y-STRs )在DNA檢驗(yàn)中已被廣泛應(yīng)用[1,2]。特別是對(duì)于男女混合檢材，Y-STR可以幫助研究者區(qū)分樣本中的男性個(gè)體，因而成為個(gè)體識(shí)別的有效手段。 2003年，美國ABI公司推出的AmpFSTR@YfilerTM熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)同步擴(kuò)增檢測17個(gè)Y-STR基因座，該技術(shù)已得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用[3]。無精子癥因子(azoospermia factor, AZF)編碼基因位于Yq11，且與精子發(fā)生相關(guān)[4,5]。該基因序列被分為4個(gè)(、、和)亞區(qū)[6~8]，包含與精子發(fā)生有關(guān)的一系列基因[9~11]。且視缺失區(qū)域的不同，可引起不同程度的精液質(zhì)量下降[12~15]。基于STR技術(shù)的性別判斷基因(amelogenin Y)含有2個(gè)等位基因座(和)，位于Xp22.1-22.3，位于Yp11.2[16,17]，目前均已被廣泛應(yīng)用到人類商業(yè)化試劑盒中。研究發(fā)現(xiàn)，部分Y-STR和基因表現(xiàn)出等位基因“丟失”(無效擴(kuò)增)現(xiàn)象，這種等位基因“丟失”現(xiàn)象與Y染色體部分缺失有密切關(guān)系[18~21]。同時(shí)，基因“丟失”現(xiàn)象，與某些特定的Y-STR無效擴(kuò)增同時(shí)發(fā)生[20,22]。然而由于樣本的多樣性、取材過程的不確定性和實(shí)驗(yàn)過程的復(fù)雜性(如樣本DNA降解、含量極低和擴(kuò)增技術(shù)等)，實(shí)驗(yàn)本身可能得到“不完整”的Y-STR分型結(jié)果。因此，這些特殊的基因型將會(huì)限制Y-STR的應(yīng)用和干擾實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)解讀，同時(shí)影響了法庭科學(xué)DNA檢驗(yàn)在此類遺傳缺陷人群中的應(yīng)用。本研究分析85例AZF基因缺失患者的Y-STR基因座缺失類型，為此類遺傳缺陷人群的遺傳標(biāo)記缺失提供科學(xué)解釋，以期幫助DNA檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)異常數(shù)據(jù)做出正確的解讀和判斷。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016年3月~2018年3月于本院就診的男性不育癥患者抗凝血85例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)Y染色體微缺失試劑盒檢測存在AZF區(qū)域缺失的男性不育患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)感染性梗阻性無精子癥；(2)特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥。所有參與者均簽署知情同意。

1.2 基因組DNA提取

采用Qiagen微量DNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)，按照說明書提取基因組DNA。

1.3 AZF微缺失STS檢測

采用Y染色體微缺失試劑盒(Y chromosome deletion detection system kit version 2.0,Promega公司，美國)檢測20個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-tagged sites, STS)。本試劑盒包含5組引物復(fù)合物(共20對(duì))，通過5組多重PCR擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex PCR)對(duì)樣本全基因組進(jìn)行擴(kuò)增。其中包含了《歐洲Y染色體微缺失分子診斷指南2014版本》[23]推薦的6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)。A組擴(kuò)增片段包含：SY254、SY157、SY81、SY130和SY182；B組擴(kuò)增片段包含：SYPR3、SY127、SY242和SY208；C組擴(kuò)增片段包含：SY128、SY121、SY145和SY255；D組擴(kuò)增片段包含：SY133、SY152和SY124；E組擴(kuò)增片段包含：SY14、SY134、SY86和SY84。A~D組選取X 連鎖的區(qū)域SMCX作為內(nèi)對(duì)照，E組選取男性和女性共有的特異性區(qū)域ZFX/ZFY(zinc-finger-Y gene,)作為內(nèi)對(duì)照。正常男性DNA為陽性對(duì)照，去離子水為空白對(duì)照。

取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，GoldViewTM染色，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行基因缺失類型判斷。區(qū)：SY81、SY86、SY84和SY182；區(qū)：SY121、SYPR3、SY124、SY127、SY128、SY130、SY133和SY134；區(qū)：SY145和SY152；區(qū)：SY145、SY152、SY242、SY208、SY254、SY255和SY157。

1.4 Y-STR和AMEL基因分型檢測

采用AmpFSTR@YfilerTM熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國)對(duì)Y染色體上17個(gè)STR基因座(和)進(jìn)行基因分型。采用PowerPlex 21熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢測試劑(Promega公司，美國)檢測基因分型。使用9700型基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司，美國)和3500 xl Dx型號(hào)遺傳分析儀(Applied Biosystems公司，美國)進(jìn)行擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為10 μL，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參照試劑盒說明書。每批樣本均采用C2800男性DNA (Promega公司，美國)和超純水分別作陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。采用Gene Mapper ID-X軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y染色體微缺失

通過20個(gè)STS檢測，發(fā)現(xiàn)單純區(qū)缺失7例(8.235%)，其中2例a區(qū)(SY86)部分缺失，另5例a區(qū)(SY86+SY84)連續(xù)缺失；單純區(qū)缺失2例(2.353%)，其中1例b區(qū)(SY134)部分缺失，1例b區(qū)(SY121+SYPR3+SY124+SY127+SY128+SY130+SY134)連續(xù)缺失；單純區(qū)缺失60例(70.588%)；區(qū)復(fù)合缺失10例(11.765%)；區(qū)復(fù)合缺失6例(7.059%) (表1，圖1)。

表1 AZF缺失類型和缺失的序列標(biāo)簽位點(diǎn)

圖1 Multiplex PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖

M：Marker; 1：正常人樣本；2：a2亞組樣本；3：c1亞組樣本；4：bcd3亞組樣本。

2.2 Y-STR和AMEL基因無效擴(kuò)增

通過檢測17個(gè)Y-STR基因座，發(fā)現(xiàn)27例(31.765%) Y染色體微缺失患者存在Y-STR基因座無效擴(kuò)增，且與STS缺失位點(diǎn)相關(guān)(圖2，圖3)。

2.2.1基因座無效擴(kuò)增

在共檢出的7例區(qū)缺失中，本研究按照缺失類型將其分為a1 (SY86缺失)和a2 (SY86+SY84缺失)兩組，其中2例a1亞組樣本Y-STR結(jié)果均顯示基因座無效擴(kuò)增；5例a2亞組樣本Y-STR結(jié)果均顯示基因座無效擴(kuò)增(表2；圖2，A和B)。

2.2.2基因座無效擴(kuò)增

在檢出的60例區(qū)缺失中,按照缺失類型將其分為c1和c2兩個(gè)組，其中2例c1組樣本(No. E6和No. I3) Y-STR結(jié)果顯示基因座無效擴(kuò)增。另外58例樣本17個(gè)Y-STR結(jié)果均正常。

圖2 樣本部分Y-STR無效擴(kuò)增示意圖

A：a1亞組(樣本：A3)；B：a2亞組(樣本：C5)；C：b1亞組(樣本：F2)；D：bcd2亞組(樣本：C1)。A：基因座無效擴(kuò)增；B：基因座無效擴(kuò)增；C：基因座無效擴(kuò)增；D：基因座無效擴(kuò)增(黑色箭頭標(biāo)記出無效擴(kuò)增位點(diǎn))。

圖3 Y染色體結(jié)構(gòu)示意圖

在檢出的2例區(qū)缺失中，按照缺失類型將其分為b1 (SY134缺失)和b2 (SY121+SYPR3+ SY124+SY127+SY128+SY130+SY134缺失)兩組，其中b1組樣本基因座無效擴(kuò)增（圖2C）；b2組樣本結(jié)果基因座無效擴(kuò)增，且無效擴(kuò)增位點(diǎn)與區(qū)復(fù)合缺失樣本相同(表2)。

2.2.3基因座無效擴(kuò)增

在檢出的10例區(qū)復(fù)合缺失中,按照缺失類型將其分為3組：bcd1、bcd2和bcd3，其中10例樣本均顯示基因座無效擴(kuò)增，另1例bcd2組樣本顯示基因座無效擴(kuò)增(表2， 圖2D)。

2.2.4基因座無效擴(kuò)增

在共檢出的6例區(qū)復(fù)合缺失中，我們按照缺失類型將其分為4組：abcd1、abcd2、abcd3和abcd4，所有樣本基因座均擴(kuò)增成功，而基因座均無效擴(kuò)增(表3)。

2.2.5基因座無效擴(kuò)增和異常擴(kuò)增

考慮到AZF大片段缺失可能影響其位置鄰近的性別相關(guān)基因，于是研究者將6例區(qū)復(fù)合缺失組樣本進(jìn)行常染色體STR檢測，觀察其和基因座。結(jié)果表明3例男性abcd4組樣本基因擴(kuò)增“丟失”，常染色體STR性別基因顯示為(XX)，1例abcd3組樣本基因擴(kuò)增異常，顯示為(XYY)。另2例樣本常染色體性別相關(guān)基因顯示為(XY) (圖4)。

3 討論

Y染色體作為男性獨(dú)有的性染色體，可分為兩端的擬常染色質(zhì)區(qū)((pseudoautosomal region, PAR)和男性特異性區(qū)域 (male-specific region of Y chrom-osome, MSY)。在減數(shù)分裂中，兩端的擬常染區(qū)(PAR1和PAR2)常與X染色體發(fā)生重組，而MSY區(qū)域不發(fā)生重組，呈父系單倍體遺傳。而Y-STR正位于其非重組區(qū)[3,24,25]。除突變外，同一家族中所有男性個(gè)體的Y-STR 分型結(jié)果理論上應(yīng)完全一致。鑒于其在同一父系家族的特異性，研究者可直接獲得男女混合檢材樣本中的男性Y染色體遺傳信息而不受女性樣本的影響。其特殊的遺傳模式，在法庭科學(xué)應(yīng)用中有其獨(dú)特的優(yōu)勢[26,27]。同時(shí)，Y染色體的非重組區(qū)(non-recombining region of Y, NPY)含有大量高度同源的重復(fù)序列，導(dǎo)致該區(qū)域具備了高度的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性，較容易發(fā)生染色體內(nèi)非等位的同源性重組(non-allelic homologous recombination, NAHR)，導(dǎo)致Y染色體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)重排，如缺失、倒置和重復(fù)等[28~31]，從而可能對(duì)Y-STR基因的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

表2 AZF部分缺失樣本和Y-STR等位基因分型

“/”代表該位點(diǎn)等位基因擴(kuò)增失敗。

表3 AZF a+b+c+d區(qū)缺失樣本的Y-STR等位基因分型

“/”代表該位點(diǎn)等位基因擴(kuò)增失敗。

研究表明，精子的發(fā)生調(diào)控與Y染色體無精子因子AZF密切相關(guān)，且該區(qū)也位于Y染色體的非重組區(qū)[32~35]。AZF基因缺失引起的生精障礙是導(dǎo)致男性不育的重要原因，表現(xiàn)為原發(fā)性無精子癥和少精癥[36]。國內(nèi)有研究表明了男性不育人群部分Y-STR無效等位基因情況，然而由于樣本數(shù)量有限，部分缺失型別未能全面涉及[18]。本研究采用美國Promega 公司的20個(gè)STS位點(diǎn)(SY81、SY86、SY84、SY182、SY121、SYPR3、SY124、SY127、SY128、SY130、SY133、SY134、SY145、SY152、SY242、SY208、SY254、SY255和SY157)的Y染色體缺失檢測商業(yè)試劑盒，將基因缺失類型分為5組。同時(shí)根據(jù)缺失位點(diǎn)將每組細(xì)分為1~4個(gè)亞組，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示單純區(qū)缺失7例(8.235%)，包括a區(qū)部分缺失和連續(xù)缺失兩個(gè)亞組；單純區(qū)單純?nèi)笔?例(2.353%)，包括 b區(qū)部分缺失和連續(xù)缺失兩個(gè)亞組；單純區(qū)連續(xù)缺失60例(70.588%)；區(qū)復(fù)合缺失10例(11.765%)，包括連續(xù)缺失和不連續(xù)缺失3個(gè)亞組；區(qū)復(fù)合缺失6例(7.059%)，依據(jù)缺失復(fù)雜程度分為4個(gè)亞組。

圖4 樣本AMELY等位基因無效擴(kuò)增和異常擴(kuò)增結(jié)果

A：男性樣本無Y峰(樣本：A1、H6、L3)；B：Y峰峰高異常(樣本：H4)。

本研究結(jié)果顯示，在Y-STR等位基因缺失模式上面，不同缺失亞組表現(xiàn)出獨(dú)特的缺失特點(diǎn)(圖2，圖3)：(1)在1亞組(SY86缺失)中，Y-STR等位基因表現(xiàn)為基因座無效擴(kuò)增（圖2A）；在AZF a2亞組(SY86+SY84缺失)中Y-STR等位基因表現(xiàn)為基因座無效擴(kuò)增（圖2B）。因此推測基因座無效擴(kuò)增可能與SY86缺失有關(guān)；基因座無效擴(kuò)增可能與SY84缺失有關(guān)，但由于此缺失類型在人群中的發(fā)生率較低，該組的樣本量較少，該結(jié)論普適性有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。(2)在組和組中，所有樣本均表現(xiàn)為基因座無效擴(kuò)增。其中區(qū)缺失的Y-STR等位基因無效擴(kuò)增與之前研究結(jié)果不完全一致，原因可能是由于樣本選擇不同而造成的差異[18]。本研究的亞組僅為SY134缺失，因此僅表現(xiàn)為基因座無效擴(kuò)增（圖2C）。目前研究結(jié)果顯示， 大部分的男性Y染色體微缺失表現(xiàn)為區(qū)缺 失[36,37]，有研究報(bào)道了區(qū)缺失與基因座無效擴(kuò)增有關(guān)，但實(shí)驗(yàn)樣本量較少，可能產(chǎn)生偏倚[18,38,39]。而在本研究的60例c區(qū)缺失樣本中僅有2例表現(xiàn)為基因座無效擴(kuò)增(3.333%)，結(jié)果偏低?；蜃鶡o效擴(kuò)增是否與區(qū)缺失有關(guān)，亦或?yàn)橐锝Y(jié)合區(qū)基因突變而導(dǎo)致的等位基因無效擴(kuò)增，尚有待進(jìn)一步研究。(3)區(qū)復(fù)合缺失全部樣本均表現(xiàn)為基因座無效擴(kuò)增，與2組缺失的Y-STR基因座相同，因此推測：基因座無效擴(kuò)增可能與(SYPR3+SY124+SY127+SY128+ SY130+SY134)缺失有關(guān)。(4)區(qū)復(fù)合缺失全部樣本均表現(xiàn)為基因座無效擴(kuò)增，根據(jù)以上結(jié)果推測基因座無效擴(kuò)增與SY182缺失有關(guān)。(5) 3例樣本4亞組等位基因“丟失”，DNA檢測表現(xiàn)為XX。與之前報(bào)道的Y染色體長臂大片段缺失導(dǎo)致丟失結(jié)果一致[20,40,41]。其機(jī)制可能為：此類大片段缺失始于Yp11.2并涵蓋了整個(gè)Y染色體長臂，以致和及整條長臂遺傳標(biāo)記物丟失，與此同時(shí)，靠近擬常染色質(zhì)區(qū)的Y染色體短臂標(biāo)記物如與X染色體發(fā)生重組，導(dǎo)致Y染色體短臂部分標(biāo)記物如SRY基因(性別決定基因)重新定位到X染色體短臂，而造成個(gè)體發(fā)育成男性特征[22,40]。然而此種缺失-重定位理論無法合理解釋樣本L3的分型結(jié)果(陰性，陽性)，有待后續(xù)對(duì)其機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。綜上所述，本研究闡明了和在基因缺失人群的遺傳異質(zhì)性，為此類遺傳缺陷人群的遺傳標(biāo)記缺失提供了科學(xué)解釋和理論依據(jù)，提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)異常Y-STR數(shù)據(jù)解讀能力。

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Alleles dropout patterns of Y-short tandem repeats in infertile males with Y chromosome microdeletions

Yanchao Wang, Xiaoyan Ma, Xiaofang Sun, Jiajia Xian, Shaoying Li, Wenzhi He, Xiaoman Wang, Qing Li

Y chromosomal short tandem repeat (Y-STR) typing is the most commonly used genetic technique in forensic studies. However, there may be a limit to the application of Y-STR in forensic science as Y-STR loci are subject to loss or variation caused by the higher chromosomal structures’ spontaneous mutation rate. Located in the long arm of the Y chromosome, azoospermia factor () have been shown to participate in spermatogenesis and its deletion could cause infertility. However, little is known about the Y-STR dropout pattern in individuals with Y chromosome microdeletions. In this study, 85 infertile males with Y chromosome interstitial deletion were identified and special Y-STR allele dropout patterns were analyzed by employing a Y-STR Commercial Kit and a Y chromosome Deletion Kit. Results demonstrate thatregion deletion are related toalleles dropout, whileregion orregion deletions correlate toallele dropout. Nullalleles were observed inregion deletion individuals. While nullalleles were observed inlarge region deletion individuals. Our data suggest that Y chromosome microdeletions may indicate specific Y-STR locus dropout patterns.

Y chromosomal microdeletions; AZF deletion; Y chromosomal short tandem repeats alleles dropout; infertility

2018-10-09;

2018-12-25

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2016A20214011)資助[Supported by Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (No. 2016A20214011)]

王燕超，碩士研究生，技師，研究方向：分子遺傳學(xué)。E-mail: wycsusan12@163.com

黎青，博士，主任醫(yī)師，主管技師，研究方向：分子遺傳學(xué)，生殖遺傳學(xué)，法醫(yī)遺傳學(xué)。E-mail: 81292522@163.com

10.16288/j.yczz.18-235

2019/1/14 13:15:29

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190114.1315.009.html

(責(zé)任編委: 楊昭慶)