郭志輝 韓煥欽 鄭偉強(qiáng)

肝功能衰竭是肝病終末期的臨床表現(xiàn)之一?，F(xiàn)如今治療肝功能衰竭的人工肝治療方法依然是非生物型人工肝(Non-Bioaritificial Liver, NBAL)，非生物型人工肝不具有肝細(xì)胞合成白蛋白、凝血因子等活性物質(zhì)的功能，但生物型人工肝(Bioaritificial Liver, BAL)卻很好地彌補(bǔ)了非生物型人工肝在合成、分泌方面的不足。本文主要介紹了生物型人工肝的干細(xì)胞的來(lái)源、誘導(dǎo)分化以及生物型人工肝的臨床應(yīng)用。作為肝功能衰竭的有效治療方式，生物型人工肝必將成為今后研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。

肝炎病毒、藥物、酒精、自身免疫性疾病等多種因素可導(dǎo)致急性、慢性肝衰竭，而肝衰竭后期患者病死率大于50%[1]，目前肝衰竭的治療方法主要還是內(nèi)科綜合治療、非生物型人工肝支持治療及肝臟移植等。內(nèi)科綜合治療主要以藥物治療，但未能立即緩解患者病情，而非生物型人工肝能明顯有效地清除患者體內(nèi)毒素及代謝廢物，改善患者內(nèi)環(huán)境、凝血功能，緩解黃疸、皮膚瘙癢、肝性腦病、腹水等癥狀體征，但由于其價(jià)格昂貴、無(wú)法降低患者病死率，所以只能用于緩解急慢性肝衰竭癥狀或橋接肝臟移植手術(shù)[2]。研究表明，肝臟移植手術(shù)是目前大部分急、慢性肝衰竭的唯一有效治療手段[3]，但肝臟供體來(lái)源不足一直是限制肝臟移植手術(shù)的主要因素[4]。

近年來(lái)研究指出，生物型人工肝能夠清除急、慢性肝衰竭患者體內(nèi)代謝性廢物，降低血清氨、膽紅素的水平，以及合成肝臟的活性物質(zhì)，如凝血因子、纖維蛋白原、白蛋白等[5]，并促進(jìn)肝衰竭患者的肝細(xì)胞再生，彌補(bǔ)了非生物型人工肝的不足[5]。生物型人工肝使用的細(xì)胞來(lái)源之一就是干細(xì)胞[5-6]，本文就干細(xì)胞的來(lái)源、誘導(dǎo)分化、生物型人工肝的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

一、干細(xì)胞的來(lái)源、誘導(dǎo)以及分化

干細(xì)胞包括人胚胎干細(xì)胞 (Human Embryonic Stem Cells, HESCs)、誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞 (Human Pluripotent Stem Cells, HPSCs) 和人間充質(zhì)干細(xì)胞( Human Mesenchymal Stem Cells, HMSCs) 等，人間充質(zhì)干細(xì)胞又包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs)、造血干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞(Adipose Stem Cells, ASCs)等。

HESCs來(lái)源于人類早期受精卵的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，Thomson等[7]研究指出HESCs能高水平地表達(dá)端粒酶活性，能夠以未分化的細(xì)胞狀態(tài)在體外無(wú)限增殖，并保持內(nèi)胚層、中胚層、外胚層的各個(gè)組織的分化潛能。在人胚胎干細(xì)胞系BG01V/hOG培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)因子及制瘤素M后可檢測(cè)出白蛋白的高度表達(dá)，意味著HESCs沿肝臟譜系分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞[8]。即使經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)和冷凍保存，HESCs產(chǎn)生的功能性肝細(xì)胞樣細(xì)胞仍保持穩(wěn)定的生理活性，在四氯化碳誘導(dǎo)的纖維化大鼠肝臟中移植冷凍保存的HESCs衍生的肝祖細(xì)胞后有顯著的治療效果，包括改善大鼠的肝組織學(xué)和肝酶的生物化學(xué)指標(biāo)以及增加大鼠的存活率，這一研究結(jié)果對(duì)臨床應(yīng)用HESCs衍生的肝譜系細(xì)胞有著重要的指導(dǎo)作用，但使用HESCs面臨著倫理道德的爭(zhēng)議[9]。

HIPSCs是從人體中的體細(xì)胞提取而來(lái)，并經(jīng)過(guò)重編誘導(dǎo)形成的具有自我更新能力及分化成任何類型細(xì)胞的潛能。2007年前人類多能干細(xì)胞(Human Pluripotent Stem Cells, HPSCs)的唯一來(lái)源是HESCs[10]，但有研究表明，Takahashi和Yamanaka2007年研究證實(shí)可以通過(guò)整合逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)了四種確定的基因OCT3 / 4，SOX2，KLF4和C-MYC，并誘導(dǎo)重編成人面部真皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生HIPSCs[11]，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，有可能完全從HIPCs誘導(dǎo)產(chǎn)生初期肝臟細(xì)胞組織[12]。此外，HIPSCs在形態(tài)學(xué)、增殖、表面抗原、基因表達(dá)、多能細(xì)胞特異性基因的表觀遺傳狀態(tài)和端粒酶活性方面與HESCs相似，HIPSCs技術(shù)的出現(xiàn)給科學(xué)家們提供了人類胚胎樣干細(xì)胞的同時(shí)也避免了許多有關(guān)使用HESCs的道德限制[10]。通過(guò)在培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子、血管生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，干細(xì)胞衍生的肝臟組織顯示肝功能超過(guò)365 d，未來(lái)可作為臨床的肝臟組織來(lái)源或體外肝臟功能支持[13]。

HMSCs存在于人類的各種組織中，具有分化成原有組織細(xì)胞或其他組織細(xì)胞的潛能，并具有再生、修復(fù)組織損傷等功能。人胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞從多種組織提取而來(lái)，包括胎兒前三個(gè)月的血液、肝臟、脂肪組織、骨髓以及胎盤、臍帶、羊水中分離提取[14-18]，研究表明，在某些條件下，HMSCs可以在體外和體內(nèi)分化成許多細(xì)胞類型，包括肝細(xì)胞[19]。迄今為止已經(jīng)開(kāi)發(fā)了四種主要方法來(lái)誘導(dǎo)HMSCs向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，分別為更改相應(yīng)化學(xué)化合物和細(xì)胞因子，進(jìn)行遺傳修飾以及微環(huán)境的調(diào)整，改變培養(yǎng)HMSCs的物理參數(shù)從而實(shí)現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。HMSCs轉(zhuǎn)化成肝細(xì)胞的同時(shí)HMSCs也通過(guò)旁分泌分泌營(yíng)養(yǎng)因子，以及與細(xì)胞增殖有關(guān)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，從而減少肝細(xì)胞凋亡的數(shù)量，起到使肝損傷患者肝臟細(xì)胞再生，改善患者肝功能的作用[20]。

二、生物型人工肝

BAL是由生物反應(yīng)器及裝置內(nèi)的分離培養(yǎng)的肝細(xì)胞或功能性肝細(xì)胞組成，在體外具有肝臟的解毒、轉(zhuǎn)化、生物合成及分泌等功能。BAL目前有體外肝臟輔助裝置(Extracorporeal Liver Assist Device, ELAD)系統(tǒng)及生物人工肝支持系統(tǒng)(Bioartificial Liver Support System, BLSS)等[21]。ELAD適合血流動(dòng)力學(xué)及腦灌注壓不穩(wěn)定、凝血功能障礙、肝性腦病的患者，能有效降低血氨，改善神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，在芝加哥大學(xué)的初始臨床試驗(yàn)中，ELAD系統(tǒng)為多個(gè)裝有100 g永生化人肝細(xì)胞的中空纖維濾筒盒及血液泵組成，治療5例暴發(fā)性肝衰竭患者，在治療過(guò)程中停用血管收縮藥物及降低吸入氧氣濃度后，血流動(dòng)力學(xué)(腦灌注及平均動(dòng)脈血壓)穩(wěn)定，治療期間患者不需要輸注任何血液制品，因此可避免血液疾病的傳播，5例患者均經(jīng)歷了257 h的治療，證明該ELAD能維持功能并連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間使用，延長(zhǎng)所有患者生存時(shí)間并成功實(shí)施肝移植手術(shù)，但治療人數(shù)較少，而應(yīng)進(jìn)行更大規(guī)模的隨機(jī)試驗(yàn)驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)結(jié)果[22]。ELAD在另一項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)中使用人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2/C3A(100 g)治療96例酒精性肝功能失代償期患者，治療91 d后血肌酐<1.3 mg/dL，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)≤2.5，存活率為93.9%，而對(duì)照組為68.4%[23]。

BLSS系統(tǒng)也是由中空纖維濾芯生物反應(yīng)器及血泵組成，約70～100 g豬肝細(xì)胞被放置于生物反應(yīng)器的外腔中。首次應(yīng)用BLSS進(jìn)行Ⅰ/Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)治療1例41歲的非洲裔美國(guó)女性特發(fā)性暴發(fā)性肝衰竭伴肝性腦病患者，BLSS灌注期間仍能保持凝血功能，但每次開(kāi)始灌注時(shí)患者出現(xiàn)短暫性低血壓、血糖降低及血小板減少10%，灌注后期血壓及血小板恢復(fù)正常，血糖降低機(jī)制尚未清楚。BLSS在第2次灌注時(shí)可迅速清除血氨、乳酸，降低血清總膽紅素、ALT、AST的水平，有效提高氧合指數(shù)，改善呼吸功能，灌注期間神經(jīng)精神系統(tǒng)未見(jiàn)惡化。BLSS治療后患者血液生化指標(biāo)得到明顯改善,其中白蛋白含量升高，凝血酶原時(shí)間、INR明顯趨向正常。BLSS適用于乳酸、血氨明顯升高合并凝血功能異常的肝性腦病患者，但缺點(diǎn)是無(wú)法清除肌酐和尿素氮[24-25]。

三、干細(xì)胞用于BAL的臨床療效

為探討新型BAL的免疫安全性，張悅等使用豬肝細(xì)胞-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作為反應(yīng)細(xì)胞，以乳糖?；鶜ぞ厶羌{米纖維支架的多層平板作為生物反應(yīng)器用于治療D氨基半乳糖誘導(dǎo)的比格犬急性肝衰竭模型，實(shí)驗(yàn)組接受治療后各個(gè)臟器均未檢測(cè)出免疫球蛋白IgM、IgG及補(bǔ)體C3的沉積，顯示出該BAL具有良好的免疫安全性[26]。

由人胎兒成纖維細(xì)胞重編程誘導(dǎo)得到人功能性肝細(xì)胞(human induced functional hepatocytes，hiHeps)并用于hiHep-BAL系統(tǒng)，hiHep-BAL系統(tǒng)的組件包括三個(gè)滾子泵，肝素泵，血漿過(guò)濾器，血漿成分分離器和多層平板生物反應(yīng)器(中空柱支架及65層圓形平板組成，均由聚碳酸酯制成)，用于治療D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭豬模型，與對(duì)照組比較，hiHep-BAL組處理的豬在第3天檢測(cè)血液生化結(jié)果提示氨和總膽紅素的血清水平明顯降低，凝血酶原時(shí)間、AST、ALT下降趨勢(shì)明顯，以及通過(guò)合成分泌人白蛋白的活性顯示代謝解毒能力并顯示出改善急性肝衰竭豬存活率的治療效果，第5天肝性腦病癥狀得到明顯緩解，在組織學(xué)、基因表達(dá)分析顯示hiHep-BAL組豬的炎癥細(xì)胞因子TNFα和IFNγ的表達(dá)及炎癥細(xì)胞因子的mRNA水平顯著下調(diào)，表明炎癥反應(yīng)消退及肝細(xì)胞的死亡減少，此外在第7天可檢測(cè)到豬肝增殖細(xì)胞及增殖的基因，豬肝組織再生，肝功能得到改善，鑒于hiHeps在治療急性肝功能衰竭豬中的顯著療效，可通過(guò)細(xì)胞球懸浮技術(shù)開(kāi)發(fā)下一代生物反應(yīng)器用于急性肝功能衰竭患者[27]。

綜上所述，干細(xì)胞用于生物型人工肝治療肝衰竭的臨床療效顯著，同時(shí)具有肝臟細(xì)胞合成分泌白蛋白、分泌凝血因子、清除血氨的功能，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，但其仍處于臨床實(shí)驗(yàn)階段。

四、討論與展望

研究報(bào)道[23, 27]，肝細(xì)胞樣細(xì)胞可來(lái)自HPSCs，因此HPSCs衍生的肝細(xì)胞可作為BAL細(xì)胞來(lái)源，但HPSCs真正用于BAL仍需要解決以下問(wèn)題： 1、生產(chǎn)臨床使用的BAL裝置至少需要450億個(gè)HPSCs來(lái)源的肝細(xì)胞，而培養(yǎng)450億HPSCs并誘導(dǎo)其分化為肝細(xì)胞的過(guò)程消耗大量培養(yǎng)基和補(bǔ)充物，對(duì)于大規(guī)模的臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)成本過(guò)于昂貴。2、目前對(duì)HPSCs衍生的肝細(xì)胞是否可以在BAL裝置中長(zhǎng)期維持其肝功能尚未研究充分，并且需要解決在整個(gè)治療過(guò)程中細(xì)胞活力和功能有可能喪失的問(wèn)題。BAL仍處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，未來(lái)進(jìn)入臨床造福患者仍需要進(jìn)一步研究。