廖燕秋，龍嘉莉，殷玉婷，何清蓮，何佩珊，朱 偉（廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東東莞 ）1.523808

提 要：隨著對結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)中DNA 甲 基化研究不斷深入，在CRC 早 期階段，DNA啟動子區(qū)域異常甲基化可作為臨床上 CRC患者早期診斷標(biāo)準(zhǔn)。目前已有較多研究報道檢測患者血液和糞便中基因異常甲基化對于早期 CRC篩查有較高的靈敏度和特異性。該文將研究較為透徹的胞裂蛋白 9 (SEPT9)、聯(lián)合分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(SFRP2)、波形蛋白(VIM)3個基因的甲基化及其在CRC 早期診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀作了綜述。

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球惡性腫瘤第3位，病死率在發(fā)達(dá)國家居第 2位，在我國居第 5位，且隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率和病死率有逐年上升的趨勢[1]。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步和許多新藥的出現(xiàn)， CRC的診治水平有所提高。但是由于其早期癥狀不明顯，許多患者就診時已錯過最佳治療時間，大部分患者的預(yù)后并未得到顯著改善。因此，早診斷、早治療是防治 CRC的關(guān)鍵。目前臨床上檢測 CRC應(yīng)用最多的是糞便隱血試驗(FOBT)和結(jié)腸鏡檢查。其中糞便隱血試驗雖然快速簡單，無痛無創(chuàng)，但是靈敏度和特異性都比較低，文獻(xiàn)報道大多不足 30%，不能滿足于 CRC的早期診斷[2]。結(jié)腸鏡檢查是診斷 CRC的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其操作具有損傷性，患者需要承受痛苦，易導(dǎo)致腸道出血、穿孔和感染，這些因素在一定程度上限制了它的應(yīng)用。因此，臨床上急需靈敏度和特異性高、損傷性低的檢測方法來對 CRC患者進(jìn)行早期診斷。

基因突變和表觀遺傳學(xué)變化是 CRC發(fā)生發(fā)展的主要原因，甚至表觀遺傳學(xué)的變化比基因突變的作用更大[3]。目前表觀遺傳學(xué)變化研究最多的是DNA的甲基化。研究認(rèn)為， DNA異常甲基化發(fā)生在腫瘤的早期，并且貫穿整個腫瘤發(fā)展過程[4]。因此，DNA異常甲基化可以作為 CRC 早期診斷分子標(biāo)記物。目前已有較多研究報道某些基因的異常甲基化對于早期 CRC的篩查和診斷有較高的靈敏度和特異性，其中胞裂蛋白 9 (SEPT9)、聯(lián)合分泌型卷曲相關(guān)蛋白 2(SFRP2)、波形蛋白(VIM)是研究比較成熟并被充分證實具有很好檢測性能的基因[5-8]。

1 SEPT9

SEPT9 基 因位于人染色體 17q25.3， 含有 17個外顯子，其基因 5 ’端 調(diào) 控區(qū)域含有 CpG島，在 CRC發(fā)生發(fā)展過程中常常被甲基化[9-11]。在腺瘤轉(zhuǎn)化為癌的過程中， SEPT9基因 m RNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)；而經(jīng)過去甲基化治療后， S EPT9基因 m RNA和蛋白表達(dá)水平會升高，表明 CRC的發(fā)展過程與 SEPT9基因甲基化有關(guān)[12]。SEPT9可通過激活 c-Jun氨基末端激酶信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子 1 (HIF-1)信號通路參與細(xì)胞增殖，通過 Rho信號通路影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn) CRC癌變的過程[13]。另外，SEPT9基因下調(diào)還可以在細(xì)胞分裂間期作用于紡錘體使細(xì)胞不能正常分裂誘導(dǎo)產(chǎn)生多核細(xì)胞[13]。研究發(fā)現(xiàn)，SEPT9 基 因有 18個轉(zhuǎn)錄本。結(jié)腸腺瘤和癌組織SEPT9_V2轉(zhuǎn)錄本甲基化模式的主要變化只局限于其中一個 CpG島，即 CpG島3 (CGI3)[14]。這個序列包含了SEPT9_V2 的 啟動序列和 ATG起始密碼。 SEPT9甲基化程度在腺瘤和 CRC 組 織中差異較大。 CRC樣本中，從 CGI3的核心到 5 ’末端都存在異常甲基化，而腺瘤中 CGI3的5 ’末端沒有甲基化，這表明從腺瘤發(fā)展為 CRC的過程中，甲基化是慢慢擴(kuò)展的[15]。因此， SEPT9甲基化檢測不僅可以特異性區(qū)分 CRC和腺瘤篩查出 CRC早期患者，大大提高患者的療效和存活率，還可以根據(jù)甲基化程度判定結(jié)直腸病變分期，便于臨床醫(yī)生制定治療方案。

馬曉穎等[10]通過檢測比較 CRC組、結(jié)直腸息肉組、健康對照組外周血中 SEPT9基因甲基化的水平，其陽性表達(dá)率分別為 7 1.26%、5 .06%、3 .23%，提示 CRC 患 者甲基化 S EPT9基因呈高表達(dá)狀態(tài)。Lofton 等[5]在CRC患者血漿樣本和正常對照檢測多個基因甲基化水平，發(fā)現(xiàn)其中 S EPT9具有較高的靈敏度(69%)和特異性(86%)，提出 S EPT9是可用于CRC篩查的生物標(biāo)志物。隨后， W arron等[6]檢測 CRC患者血漿中 S EPT9基因甲基化發(fā)現(xiàn)靈敏度為 90%，特異性為 88%，其中早期(I～ II期)和晚期(Ⅲ～Ⅳ期)靈敏度分別為 87%和100%，同樣證實了血漿游離SEPT9基因甲基化可以作為 CRC新的篩查方式。糞便含有脫落的正常結(jié)直腸細(xì)胞和癌細(xì)胞，以及游離的正常DNA 和 癌DNA； 由于腸道是堿性環(huán)境，有利于DNA的保存，糞便中提取的 DNA質(zhì)量較好[16]。因此糞便基因甲基化可作為篩查診斷 CRC的一種重要輔助手段。趙慧霞等[16]通過對 126例CRC患者手術(shù)切除的癌組織、癌旁組織和術(shù)前糞便中提取的 DNA進(jìn)行SEPT9 基 因甲基化檢測，結(jié)果顯示 CRC 組 織SEPT9基因甲基化水平為 84.1%，癌旁組織 S EPT9甲基化水平為 7 .9%，其中 I～ II期 CRC中SEPT9甲基化檢出率為86.7%，Ⅲ～Ⅳ期 CRC 中 檢出率為 8 1.8%，CRC 患者糞便 SEPT9基因甲基化檢測結(jié)果與組織檢測結(jié)果一致，其臨床分期檢出率也一致，提示糞便基因SEPT9甲基化檢測對于早期診斷 CRC及癌前病變具有較高的臨床價值。血漿 SEPT9甲基化檢測篩查 CRC已在臨床上得到應(yīng)用，第一代血漿 SEPT9甲基化檢測試劑盒(EpiproColon)2012年已經(jīng)在美國使用。而第二代的試劑盒(EpiproColon 2.0)技術(shù)方面有較大改進(jìn)，在診斷的靈敏度和特異性方面也有明顯提高。目前外周血甲基化 SEPT9基因檢測篩查 CRC的方法已在歐美國家大規(guī)模使用[12]。國內(nèi)已有公司授權(quán)代理第二代 S EPT9基因甲基化 CRC檢測試劑盒，初步臨床試驗結(jié)果顯示檢出 CRC的敏感度為 7 4.8%，總體特異性高達(dá) 87.4%[17]。表明第二代試劑盒對我國 CRC篩查有重要意義。目前尚無文獻(xiàn)報道糞便基因SEPT9甲基化檢測應(yīng)用于臨床，因此具有良好的應(yīng)用前景。

2 SFRP2

SFRP2 基 因位于人染色體 4 q31 ， 包含 2個內(nèi)含子和 3個外顯子。 SFRP2可以作為拮抗因子與 Wnt受體卷曲蛋白結(jié)合抑制 Wnt/β-catenin信號通路的信號傳導(dǎo)[18]。因此， SFRP2基因被認(rèn)為是一種抑癌基因。SFRP2在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，可能與其基因啟動子區(qū)甲基化有關(guān)[19]。Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控細(xì)胞的生長、分化和運動， β -catenin作為Wnt/βcatenin信號通路的核心元件，其表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的原因[20]。樊漪波等[21]研究發(fā)現(xiàn)SFRP2 啟 動子區(qū)域甲基化頻率及 β -catenin異 常表達(dá)率在 CRC中上調(diào)，兩者共同促進(jìn)了 CRC的發(fā)生發(fā)展。 SFRP2是 Wnt信號通路的拮抗因子，當(dāng) SFRP2基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化時， SERP2表達(dá)下調(diào)或沉默，激活 Wnt信號通路， β -catenin在 胞質(zhì)內(nèi)蓄積并進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮促癌作用[21]。

Sui等[22]檢測到CRC患者、結(jié)直腸腺瘤患者、結(jié)直腸息肉患者和健康人 SFRP2基因甲基化率分別為86.6% 、72.0%、46.1% 、 0% ； 而 韓 國 CRC 和結(jié)直腸腺瘤 SFRP2 甲 基化率分 別 為60% 和44%[23]；日本CRC 為 61.7%，腺瘤或息肉 為 3.9%，正?？寺○つそM織為 0 %[24]， 這 表明中國SFRP2基因甲基化程度高于其他 亞 洲國家[22-24]。在 CRC患者組織、血液和糞便中可以出現(xiàn) SFRP2 甲 基化[22]。Yang等[25]對CRC 患者、良性黏膜病變患者與健康對照組的血液樣本和糞便進(jìn)行了 SFRP2基因甲基化分析，血液樣本檢測結(jié)果顯示， CRC患者 SFRP2甲基化明顯高于良性黏膜病變患者，而良性黏膜病變患者與健康對照組的SFRP2 甲基化程度差異不明顯，血液樣本中SFRP2 甲 基化與 CRC 相關(guān) 性不大；而CRC患者和良性黏膜病 變 患者糞便中 SFRP2甲基化顯著高于健康對照組。良性黏膜病變患者 SFRP2甲基化顯著高于健康對照組，糞便中 SFRP2甲基化與CRC顯著相關(guān)，糞便檢查對 SFRP2的靈敏度和特異性分別為71%和94%， 提示 糞 便 SFRP2基因甲基化可作為CRC 診 斷和篩查的分子標(biāo)志物。 N ouraie等[7]認(rèn)為檢測糞便 SFRP2基因甲基化程度 對于 診斷早期和晚期CRC 都 有 較 高的準(zhǔn)確性，對 SFRP2基因甲基化進(jìn)行分析的結(jié)果靈敏度為 7 4.5%，特 異 性為93.0%。Zhang等[26]報道對糞便 SFRP2基因甲基化檢測結(jié)果靈敏度為43%，特 異 性為 94%。程之 紅[27]分別對腸病患者和正常對照者的糞便提取 DNA，通過甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)分析 SFRP2基因甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示 CRC、腺瘤、增生性息肉和潰瘍性結(jié)腸炎患者SFRP2 基 因甲基化 陽 性率分別為94.2%、52.4%、37.5%和16.7% ，檢 測 SFRP2 基 因甲基化 診 斷CRC及癌前病 變 的靈敏度和特異性分別為90.5%和85.4%。這些研究結(jié)果表明，糞便中 SFRP2甲基化的檢測有較高的靈敏度和特異性， SFRP2可作 為 CRC潛在的無創(chuàng)性分子標(biāo)志物。糞便 SFRP2基因甲基化檢測有望成為篩查 CRC 高 風(fēng)險人群和 CRC 早期診斷的一個新途徑。

3 VIM

VIM 基 因位于染色體10p13，DNA 全 長約10kb，編碼 464個氨基酸殘基。 VIM屬中間纖維家族，參與細(xì)胞增殖、凋亡、粘附、遷移等過程，還與信號傳導(dǎo)及炎癥發(fā)生有關(guān)。在正常間充質(zhì)細(xì)胞中VIM表達(dá)Wnt靶向活性，編碼參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和完整性的中間絲蛋白[28]。VIM是一種潛在的腫瘤治療靶點，因它在許多腫瘤中過度表達(dá)，且與轉(zhuǎn)移進(jìn)展有關(guān)[28]。VIM與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的重要過程[29]。 VIM還可影響細(xì)胞凋亡，其在胞質(zhì)內(nèi)能與 P 53蛋白結(jié)合，促進(jìn) P 53入核，從而加快細(xì)胞凋亡的過程[30]。 VIM基 因CpG島 甲基化在 CRC 發(fā)生中起重要作用，組織中檢出率在 80%左右，而正常人結(jié)直腸組織中檢測不到VIM基因甲基化[31-32]。研究表明，在診斷特異性高達(dá) 95%的情況下 CRC和結(jié)直腸腺瘤樣本組織的甲基化率分別為8 6 %和76%[8]。付蕾等[32]提取正常結(jié)直腸新鮮組織、 CRC新鮮組織及糞便 DNA進(jìn)行甲基化特異性 PCR檢測，結(jié)果顯示正常結(jié)直腸組織中未檢測到 VIM基因甲基化。 CRC組織中 VIM基因甲基化的檢出率為 80%， CRC 患 者糞便中 VIM基因甲基化檢出率為 36%，但對于早期 CRC患者糞便的 VIM基因甲基化檢出率為 6 6.7%。由于 VIM在糞便中很容易被檢測到，成為市場上第一個可用的基于甲基化DNA診斷測試的靶基因[33-34]。因此， VIM 基因甲基化檢測可作為 CRC患者早期診斷的分子標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于臨床。

4 小結(jié)

CRC是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，表觀遺傳學(xué)的變異特別是 DNA甲基化在 CRC的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。 DNA甲基化是基因表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制之一，幾乎在所有腫瘤細(xì)胞中存在著DNA甲基化紊亂，啟動子區(qū)域 C pG島 高甲基化可使一些抑癌基因表達(dá)下調(diào)甚至沉默。在 CRC發(fā)生發(fā)展過程中，血液或糞便中 S EPT9、 SFRP2、 VIM基因的甲基化水平均高于正常人，提示 S EPT9、 SFRP2、VIM 可 作為 CRC 早期診斷的分子標(biāo)志物。其中血漿SEPT9 甲 基化檢測、糞便 VIM 甲基化檢測已在臨床上使用。大量研究表明糞便 S EPT9、 SFRP2、 VIM基因甲基化檢測有較高的靈敏度和特異性，這為大批不愿做結(jié)腸鏡檢查的潛在 CRC患者提供了一種高效方法，對 CRC高危人群的篩查及早期診斷具有重要意義。早期診斷 CRC可以對患者進(jìn)行早期治療，這樣可以明顯改善患者的臨床治療效果，改善患者的預(yù)后，對CRC的防治具有非常重要的作用。