張運克，劉沖沖

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

補脾益腎起痿湯是全國第三、四批名老中醫(yī)鄭紹周教授多年來治療重癥肌無力的經(jīng)驗方，以補中益氣湯和二仙湯化裁而成，經(jīng)多年的臨床研究，對肌無力辨證為脾腎虧虛型的有效率達80%以上。為了探討本方治療肌無力的作用機理，我們通過采用人工合成免疫原制作實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠模型，采用抗原包被法測定大鼠血清AChR-Ab水平；應(yīng)用ELISA法檢測大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-2、IL-6、IL-17A和IFN-γ的濃度變化，初步探討補脾益腎起痿湯通過調(diào)節(jié)輔助性T細胞相關(guān)因子治療MG的免疫學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康lewis雌性大鼠72只，年齡42～62天，體質(zhì)量150～160 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：11400700140544。河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)。將大鼠按隨機數(shù)字表分為空白對照組、模型組、強的松對照組、補脾益腎起痿湯高中低3個劑量組共6個組，每組大鼠12只。

1.2 主要試劑和儀器

人工合成免疫原：人工合成鼠源性AChR-α亞基97～116肽段序列由上海淘普生物科技有限公司合成。規(guī)格：6 mg/支，分子量：2 252.62，純度：98.67%，序列號：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI(20aa)；完全福氏佐劑(CFA):購自美國Sigma公司,規(guī)格：10 mL/瓶，貨號：F-5881；不完全福氏佐(IFA)：購自美國Sigma公司,規(guī)格：10 mL/瓶，貨號：F-5506；磷酸緩沖液(PBS)購于Solarbio公司；大鼠/IL-6 、IFN-γ、IL-17A 、L-2 ELISA試劑盒購于達科為公司；iMark酶標(biāo)儀購自北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實驗藥物

補脾益腎起痿湯由黨參20 g，仙靈脾15 g，黃芪50 g，升麻15 g，柴胡15 g，生白術(shù)15 g，陳皮10 g，當(dāng)歸15 g，炙甘草15 g，仙茅15 g組成，進行濃煎后裝瓶備用，每毫升濃煎液含生藥0.74 g。

對照藥醋酸潑尼松片：H33021207，購于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。

1.4 實驗?zāi)Ｐ椭苽?/h3>

方法參考許文華[1]免疫乳劑的制備：由R 97～116、CFA、PBS三者按1∶1.5∶1.5的比例充分混勻制成；首次免疫:取乳劑200 μL(含100 μgR97～116)，于造模鼠背部多點、足墊皮下注射，對照組給予同等劑量的佐劑與PBS混合乳劑。第2次及第3次免疫：首次免疫后第30天及第45天,造模組每只大鼠含多肽100 μg,與100 μLPBS充分混合后加入100 μLIFA在混勻機上攪拌20 min后，最終制成油包乳液,再取乳劑200 μL(含100 μgR97～116)強化接種，對照組同樣注射等量PBS和佐劑，方法同首次免疫。

1.5 給藥方法

將60只EAMG大鼠隨機分為5組，每組12只給予灌胃治療，其中模型組給予生理鹽水每日3 mL，補脾益腎起痿湯高、中、低濃度組分別按64.8 mg/(kg·d)、32.4 mg/(kg·d)、16.2 mg/(kg·d)給予實驗藥物，西藥組給予醋酸潑尼松片5.4 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃4周。另外12只空白組大鼠給予生理鹽水每日3 mL。

1.6 實驗指標(biāo)的測定

1.6.1 組織液的制備

每組大鼠腹主動脈取血，離心15 min取血清，進行分裝每管120 μL，-20℃保存?zhèn)溆?。各?.2 g脾臟、胸腺組織，分別加入0.3 mL生理鹽水，進行勻漿，隨后再加入0.2 mL生理鹽水稀釋，吸取組織液，放入3 mLEP管內(nèi)，以轉(zhuǎn)速2 500 rpm，離心20 min，取出細胞上清液，分裝后放入-20℃冰箱。

1.6.2 大鼠血清中AChR-Ab濃度的測定

將血清提前放入4℃緩慢解凍10 h，觀察有無沉淀，如有快速離心1 min，采用抗原包被法測定血清AChR-Ab水平。方法如下：將R97-116(5 μg/mL)100 μL/孔包被96孔板，4℃過夜。棄用包被液洗板，取10 μL血清放入990 μL的PBS中稀釋，將每孔加入稀釋后血清100 μL/孔，設(shè)置空白孔，37℃溫浴30 min，期間取1 μL的辣根過氧化酶兔抗鼠IgG放入99 μL的PBS中稀釋，取稀釋好的液體20 μL放入3 980 μL的PBS繼續(xù)稀釋備用。溫浴時間到達后洗板，之后加入稀釋好的辣根過氧化酶兔抗鼠IgG 50 μL/孔37℃孵育30 min后洗板，加入底物和顯色劑(1∶1)混合液50 μL/孔溫浴10 min,再加入50 μL/孔2 mol/LH2SO4后采用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的吸光度值。

1.6.3 大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的濃度的測定

采用ELISA法檢測大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的濃度，具體檢測方法按試劑盒操作要求進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中AChR-Ab濃度

表1 各組大鼠血清中AChR-Ab 濃度(OD值)結(jié)果

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表1可以看出，模型組血清中AChR-Ab 濃度明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)。西藥對照組及實驗藥物各劑量組均能夠降低模型組大鼠血清中AChR-Ab濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；實驗藥物各劑量組與西藥對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。實驗藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，但隨著藥物濃度的增高，降低的幅度逐漸增強。

2.2 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-2濃度比較

表2 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-2濃度比較

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表2可以看出，模型組大鼠胸腺及脾臟組織中IL-2濃度較正常組相比明顯升高，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。實驗藥物高中低組能夠降低模型組大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-2濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；與西藥對照組降低作用相比無顯著性差異(P>0.05)。實驗藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，降低IL-2濃度的幅度隨實驗藥物的劑量增加逐漸增強。

2.3 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-6濃度對比

表3 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-6濃度比較

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表3可以看出，模型組大鼠胸腺及脾臟組織中IL-6濃度較正常組相比明顯升高，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。實驗藥物高中低組能夠降低模型組大鼠胸腺及脾臟組織液中IL-6濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；與西藥對照組降低作用相比無顯著性差異(P>0.05)。實驗藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，降低IL-6濃度的幅度隨實驗藥物的劑量增加逐漸增強。

2.4 各組胸腺、脾臟組織液中IL-17A濃度對比

表4 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IL-17A濃度比較

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表4可以看出，模型組胸腺、脾臟組織液中IL-17A濃度明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)。西藥對照組及實驗藥物各劑量組均能夠降低模型組大鼠胸腺、脾臟組織液組織液中IL-17A濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；實驗藥物各劑量組與西藥對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。實驗藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，但隨著藥物濃度的增高，降低的幅度逐漸增強。

2.5 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度比較

表5 各組大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度比較

注：與空白組相比，△P<0.01，與模型組相比，▲P<0.01

從表5可以看出，模型組大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度較正常組相比明顯升高，兩組相比有顯著性差異(P<0.01)。實驗藥物高中低組能夠降低模型組大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度，與模型組相比均有顯著性差異(P<0.01)；與西藥對照組降低作用相比無顯著性差異(P>0.05)。實驗藥物高中低劑量組之間相比無顯著性差異(P>0.05)，降低大鼠胸腺、脾臟組織液中IFN-γ濃度的幅度隨實驗藥物的劑量增加逐漸增強。

3 討論

MG是具有細胞免疫依賴性,體液免疫介導(dǎo),補體參與,針對神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜上AchR的自身免疫性疾病[2]。輔助性T細胞通過分泌不同的細胞因子影響MG的發(fā)病。其主要亞型包括Th1、 Th2 Th17等。Th1細胞分泌干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)等，通過細胞因子網(wǎng)絡(luò)的相互作用影響免疫應(yīng)答,并輔助抗AchR抗體的產(chǎn)生。巨噬細胞及Th1細胞還直接損害NMJ及其AchR[3]。IL-2是參與免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子之一，在MG的發(fā)病機制中起到促進機體抗體的產(chǎn)生，加速T、B細胞活化、增殖、分化，使其活性增強，又可以通過增強自然殺傷細胞的殺傷毒性而促進機體產(chǎn)生一系列的炎性反應(yīng)[4]。INF-γ由活化的Th1細胞產(chǎn)生，是一種促進機體產(chǎn)生炎性作用的因子，是EAMG的中心效應(yīng)分子之一。INF-γ可以激活抗原提呈細胞，使其進一步擴增，活化AChR特異性T細胞，促進B細胞的成熟，使其突觸后膜的乙酰膽堿抗體增加，從而引起NMJ的失調(diào)[5]。在MG發(fā)病過程中，INF-γ表現(xiàn)活躍，作為AChR-ab生成的必要因子，也作為驅(qū)動因子,能加速INOS的活化，導(dǎo)致NO大量生成，參加細胞毒性作用，使EAMG大鼠NMJ處產(chǎn)生免疫損傷[6-7]。Th2細胞分泌IL-6等,與Th1相關(guān)的IFN-γ協(xié)同,輔助AchR特異性的B細胞增殖并產(chǎn)生抗AchR抗體[8]。IL-6參與B細胞成熟分化成漿細胞，并通過IL-6R而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，是誘導(dǎo)免疫球蛋白產(chǎn)生的必需因子之一，能通過T細胞促進IL-2表達，研究表明，在MG患者中，發(fā)現(xiàn)血清IL-6表達明顯高于正常人，隨著患者癥狀的減輕，血清亦IL-6水平下降[9]，IL-6在MG發(fā)病中起促進作用[10]。Th17細胞主要分泌IL-17A等細胞因子[11]。IL-17是急性反應(yīng)性細胞因子，IL-17A是該家族的成員之一，能夠誘導(dǎo)促炎因子(如IL-6,TNF)以及趨化因子表達，使更多的免疫細胞到達炎癥部位造成對機體的損害[12]。IL-17A對T細胞的活化起協(xié)同刺激作用，并能促進樹突狀細胞的成熟，并在多種自身免疫性疾病中起到重要作用[13]。 IL-17A，參與自身免疫反應(yīng)、過敏反應(yīng)、腫瘤免疫以及對抗細菌和真菌感染的宿主防御反應(yīng)[14]。Mu 等[15]報 道 EAMG 存 在 Th1、Th2、Treg 及Th17 細胞比例的失調(diào)。由此可見，MG的發(fā)生并不是單一因素的參與，而是多種因素形成的瀑布鏈，共同導(dǎo)致MG的發(fā)病。

補脾益腎起痿湯由補中益氣湯合并二仙湯君藥組成，補中益氣湯作為補益脾胃的代表方，具有升提中氣的作用，對于“中氣下陷”的肌無力(痿證)具有明顯的臨床療效，符合“治痿獨取陽明”原則。徐鵬等[16]采用系統(tǒng)評價方法發(fā)現(xiàn)，補益脾胃的中藥可調(diào)控免疫相關(guān)細胞因子如IL-4、 IL-6、 IFN-γ、 TGF-β、TNF-α的變化，改善自身免疫性重癥肌無力動物癥狀。吳周燁等[17]報道：黃芪、柴胡、升麻、桔梗等升提藥物可以改善Rα97-116免疫Lewis大鼠構(gòu)建的EAMG模型臨床癥狀及體質(zhì)量下降趨勢，其機制可能是升高TGF-β含量，降低IFN-γ、IL-17含量。二仙湯君藥仙茅、仙靈脾具有補腎精、助腎陽的作用，和補中益氣湯合用適用于慢性緩解期重癥肌無力的作用，符合“補北”治療痿證的治則。張麗香等[18]報道：以補中益氣湯聯(lián)合補腎藥物組成的溫腎健脾方對重癥肌無力患者增高的IL-6有明顯的降低作用。從本研究的結(jié)果來看，補脾益腎起痿湯通過降低人工合成免疫原制作實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠模型胸腺及脾臟組織液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ濃度，影響輔助性T細胞平衡，降低了血清AChR-Ab含量，起到拮抗炎癥反應(yīng)，減輕肌無力癥狀的作用。本研究從影響輔助性T細胞平衡的免疫作用方面，揭示了補脾益腎中藥復(fù)方治療重癥肌無力(痿證)的作用機理，為該類方藥的臨床應(yīng)用奠定藥理學(xué)基礎(chǔ)。