王秀芹，路其鳳 綜述，司元全 審校

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，山東濟(jì)南 250021)

肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)病率在世界惡性腫瘤中居第5位，病死率位居第3位。我國(guó)HCC發(fā)病率和病死率分列所有惡性腫瘤的第4位和第3位，其預(yù)后差且復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。目前，HCC診斷標(biāo)志物主要是甲胎蛋白(AFP)和異常凝血酶原Ⅱ(PIVKA Ⅱ)，前者在妊娠生理情況下或重型肝炎、肝硬化等良性疾病患者血清中也會(huì)升高。35%～40%的原發(fā)性HCC患者血清AFP呈低水平升高，尤其是小HCC，AFP水平升高不明顯，甚至正常[1]。PIVKA Ⅱ檢測(cè)結(jié)果影響因素較多，如凝血功能異常、肝硬化等均可引起其水平升高，這些因素可能會(huì)影響其對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷[2-3]。肝腫瘤切除術(shù)、肝移植、介入放射治療和化療栓塞仍是HCC治療的主要選擇。但其預(yù)后效果不理想。因此，早期HCC的診斷迫切需要有效的、靈敏的、特異的生物標(biāo)志物。另外，HCC治療還需更多的、有效的生物療法。有研究表明，外泌體miRNAs在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，隨著大量的相關(guān)研究成果的陸續(xù)出現(xiàn)，可以預(yù)見(jiàn)，外泌體miRNAs在HCC診治方面將占有越來(lái)越重要的地位。本文總結(jié)了近年來(lái)外泌體miRNAs與HCC之間關(guān)系的研究成果，以期更好地了解其在HCC診治方面的功能和應(yīng)用。

1 外泌體與外泌體miRNAs概述

外泌體是直徑約為30～150 nm、密度為1.13～1.21 g/mL的小囊泡，包含RNA、蛋白質(zhì)、miRNA、DNA片段等多種成可分?？纱嬖谟谘骸⑼僖?、尿液和母乳等體液中，包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的幾乎所有類(lèi)型細(xì)胞均可產(chǎn)生并釋放外泌體[4]。有研究表明，外泌體參與了細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，有望在多種疾病的早期診斷中發(fā)揮作用。

miRNAs是一類(lèi)內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其能與特定的目標(biāo)信使RNA(mRNA)的3′非編碼區(qū)結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄后水平引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。近年來(lái)，miRNAs在惡性腫瘤診治方面的應(yīng)用越來(lái)越多[5]。有研究表明，miRNAs不僅可作為HCC診斷和預(yù)后評(píng)估的敏感生物標(biāo)志物，且還可用于HCC的治療。外泌體miRNAs較單純miRNAs在檢測(cè)和治療HCC方面更靈敏，且其穩(wěn)定性較miRNAs大得多，因此，其具有更重要的生物學(xué)特性。最近有研究表明，外泌體miRNAs參與了HCC的增生、凋亡、抑制等，同時(shí)，影響其侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后，誘導(dǎo)免疫耐受及耐藥性形成。HCC外泌體可能通過(guò)不同種類(lèi)miRNAs的異常表達(dá)間接調(diào)控HCC的致病機(jī)制，是影響HCC發(fā)病的最重要成分之一[6]。

2 外泌體miRNAs在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用

有研究表明，多種外泌體miRNAs介導(dǎo)腫瘤與腫瘤微環(huán)境之間的生物信息傳遞，參與了HCC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等進(jìn)程。

2.1外泌體miRNAs與HCC細(xì)胞增殖 miR-122是一種肝臟特異性抗增殖miRNA，將人HCC細(xì)胞Huh7和HepG2(miR-122缺陷)共培養(yǎng)后，后者吸收培養(yǎng)液中外泌體miR-122。miR-122可有效抑制HepG2細(xì)胞靶mRNA的表達(dá)，并降低受體HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖速度。且在2種細(xì)胞共培養(yǎng)過(guò)程中HepG2細(xì)胞分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)，減少miR-122在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)。因此，2種不同的HCC細(xì)胞之間存在相互影響，且這種相互作用是通過(guò)細(xì)胞間外泌體介導(dǎo)的miR-122轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)的[7]。HCC患者血清外泌體中的miR-9-3P水平明顯降低，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5(HBGF-5)在細(xì)胞增殖中具有重要作用，后者是miR-9-3P潛在的靶mRNA，miR-9-3p的過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)了HBGF-5在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，進(jìn)而影響了HCC細(xì)胞的存活率和增殖[8]。最近有研究表明，在癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)衍生的外泌體中miR-320a水平顯著降低。體內(nèi)外研究表明，miR-320a可通過(guò)直接與下游靶——PBX3結(jié)合而抑制HCC細(xì)胞增殖[9]。miR-142和miR-223存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)而HCC細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有，有研究表明，HCC細(xì)胞可攝取巨噬細(xì)胞所分泌的含miR-142和miR-223的外泌體，抑制stathmin-1和IGF-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制這些癌細(xì)胞的增殖[10]。

2.2外泌體miRNAs與HCC轉(zhuǎn)移 HCC介導(dǎo)的外泌體miRNAs能促進(jìn)其局部擴(kuò)散，誘導(dǎo)HCC肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或多灶性生長(zhǎng)。有研究表明，來(lái)自HCC細(xì)胞的外泌體miRNAs可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶-1的表達(dá)和相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)，并促進(jìn)受體細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[11]。在另一項(xiàng)研究中外泌體miR-335-5p在體外抑制HCC細(xì)胞增殖和侵襲，并在體內(nèi)誘導(dǎo)HCC萎縮[12]。有研究表明，遷徙能力強(qiáng)的HCC細(xì)胞系的外泌體攜帶大量的miRNAs，可顯著提高非運(yùn)動(dòng)性細(xì)胞的遷移和侵襲能力[13]。有研究使用丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白刺激肥大細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，刺激后外泌體內(nèi)共計(jì)19個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中miR-490水平顯著提高。后者可增加HepG2細(xì)胞miR-490水平，從而抑制ERK1/2通路進(jìn)而最終抑制HCC的轉(zhuǎn)移[14]。臨床資料顯示，血清外泌體miR-1247-3P水平與HCC患者肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。

2.3外泌體miRNAs與HCC腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境是指腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境具有密切的關(guān)系。腫瘤外泌體是介導(dǎo)局部和遠(yuǎn)處微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵介質(zhì)[16]。CHEN等[17]發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNAs參與了由環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引起的HCC癌變過(guò)程中的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，其中miR-155增強(qiáng)炎性反應(yīng)，其表達(dá)水平與白細(xì)胞介素-6(IL-6)和IL-8呈正相關(guān)。CAFs作為腫瘤微環(huán)境的一個(gè)重要組成部分，幾乎與所有癌癥疾病的發(fā)展過(guò)程相關(guān)，而外泌體miRNAs的異常調(diào)節(jié)促進(jìn)了CAFs的產(chǎn)生和激活[15,18]。最新研究表明，高轉(zhuǎn)移的HCC細(xì)胞的外泌體miR-1247-3p可促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移小龕的形成，從而誘導(dǎo)CAFs活化，加速了HCC的肺轉(zhuǎn)移[15]。ZHANG等[9]分離出CAFs及癌旁相關(guān)成纖維細(xì)胞(PAFs)發(fā)現(xiàn)，miR-320a在CAFs及HCC細(xì)胞中表達(dá)水平較低，而在PAFs中表達(dá)水平相對(duì)較高，提示CAFs介導(dǎo)的HCC腫瘤進(jìn)展與其外泌體中抗腫瘤miR-320a的缺失相關(guān)。

3 外泌體miRNAs與HCC診斷、預(yù)后評(píng)估及治療

HCC一般不易診斷，大多數(shù)HCC患者被確診時(shí)已處于中晚期。目前，HCC常規(guī)治療方式效果不盡理想。因此，早期HCC的診斷迫切需要靈敏的、特異的生物標(biāo)志物。此外，還需更多有效的治療HCC的生物療法及評(píng)估HCC患者預(yù)后的生物指標(biāo)。有研究表明，外泌體miRNAs正是符合這一要求的理想標(biāo)志物。

3.1外泌體miRNAs與HCC診斷及預(yù)后評(píng)估 不同外泌體miRNAs在HCC血清或細(xì)胞培養(yǎng)液中表達(dá)可上調(diào)也可下降。有研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清外泌體miR-665水平明顯高于健康受試者。HCC血清外泌體miR-665水平與腫瘤大小、局部浸潤(rùn)、臨床分期和生存時(shí)間均密切相關(guān)，血清外泌體miR-665水平越高，患者臨床情況越差，表明血清外泌體miR-665可能是一種用于HCC診斷和判斷預(yù)后的新的微創(chuàng)性生物標(biāo)志物[19]。另外，有研究表明，HCC患者血清外泌體miR-21水平高于乙型肝炎患者和健康對(duì)照組，血清外泌體miR-21水平與肝硬化或晚期腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。盡管血清miR-21具有類(lèi)似的結(jié)果，但檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)低于血清外泌體miR-21[20]。另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，HCC患者血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222、miR-224水平顯著高于慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化患者，但血清相關(guān)miRNAs水平在HCC組和對(duì)照組之間的差異較小[21]。表明血清外泌體miRNAs與血清循環(huán)miRNAs水平相比，能更好地用于HCC的診斷及預(yù)后評(píng)估。此外，也有研究表明，HCC外泌體miRNAs表達(dá)下降，HCC患者血清外泌體miR-101、miR-106b、miR-122、miR-195較CHB和肝硬化患者表達(dá)水平顯著降低[21]。另外，HCC患者血清外泌體中的miR-9-3P表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組[8]。另一項(xiàng)研究表明，HCC患者血清外泌體miR-638與腫瘤大小、血管浸潤(rùn)、臨床病理分期呈負(fù)相關(guān)，外泌體miR-638表達(dá)降低常提示HCC患者預(yù)后不良[22]。肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的HCC患者血清外泌體miR-718水平較未復(fù)發(fā)者低，miR-718丟失與HCC預(yù)后不良有關(guān)[23]。另一項(xiàng)研究表明，HCC血清外泌體miR-125b表達(dá)水平與腫瘤數(shù)目和病理分期有關(guān)，低水平miR-125b HCC患者常伴較短的復(fù)發(fā)時(shí)間和較低的總生存率。外泌體miR-125b可作為評(píng)估HCC患者預(yù)后的準(zhǔn)確、有效的指標(biāo)[24]?？傊?，血清外泌體miRNAs可作為判斷HCC患者預(yù)后的新的生物標(biāo)志物。

3.2外泌體miRNAs與HCC治療 外泌體miRNAs相關(guān)研究為癌癥治療提供了新的方向，作為一種有效的抗HCC的免疫治療方式，理論上減少了潛在的不良反應(yīng)。脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)可穩(wěn)定產(chǎn)生外泌體，后者表現(xiàn)出有效的免疫活性[25]。miR-122是影響肝臟發(fā)育和代謝功能的關(guān)鍵因素，其缺失與HCC密切相關(guān)[26]。將表達(dá)miR-122質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至AMSC，收集AMSC產(chǎn)生的外泌體(122-EXO)并加入到受體HCC細(xì)胞(HepG2)中。結(jié)果顯示，miR-122轉(zhuǎn)染的AMSC能有效產(chǎn)生富含miR-122的外泌體，通過(guò)改變HCC細(xì)胞中miR-122靶基因的表達(dá)而使癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感。此外，瘤內(nèi)注射122-EXO可顯著提高索拉非尼在體內(nèi)對(duì)HCC的抗腫瘤作用[27]。正如前文所述，星狀細(xì)胞衍生的外泌體miRNA(如miR-335-5p)可在體內(nèi)遞送誘導(dǎo)HCC萎縮；CAF衍生的外泌體中miR-320a抑制HCC進(jìn)展。這均為HCC提供了新的治療方案[9,12]。治療HCC，除直接將抑制腫瘤外泌體miRNAs轉(zhuǎn)移至HCC細(xì)胞外，還可用外泌體miRNAs調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。具體而言，CAFs、免疫細(xì)胞或腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞均可由外泌體miRNAs調(diào)控。T淋巴細(xì)胞衍生的外泌體miRNAs(主要是miR-92a)可在抗原呈遞細(xì)胞中發(fā)揮功能，促進(jìn)免疫應(yīng)答[28]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞將外泌體miRNAs轉(zhuǎn)移至輔助性T淋巴細(xì)胞，其中外泌體Let-7d有助于抑制和預(yù)防全身性疾病[29]。因此，外泌體miRNAs可作為HCC的潛在免疫治療方式。

4 面臨問(wèn)題

如前文所述，外泌體miRNAs在HCC診療及預(yù)后評(píng)估方面均具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但也存在一些問(wèn)題。首先是外泌體提純問(wèn)題：當(dāng)前外泌體提純方法(試劑)多種多樣，提取的數(shù)量和質(zhì)量效果均存在差異，目前公認(rèn)的分離方法依然是超速離心法，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)且缺乏較統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。此外，用于分離外泌體的試劑非常昂貴。因此，建立低成本且節(jié)省時(shí)間的分離和純化方法是非常必要的。

其次在外泌體miRNAs用于HCC診斷及預(yù)后評(píng)估方面：對(duì)同一種外泌體miRNA不同的研究有不同的結(jié)論。一方面是由于研究中所包含的研究對(duì)象數(shù)量不夠；另一方面是研究對(duì)象之間的個(gè)體差異較大，導(dǎo)致后續(xù)的生物信息學(xué)檢測(cè)結(jié)果也可能發(fā)生變化。因此，在分析HCC外泌體miRNAs的差異表達(dá)時(shí)研究者必須考慮各種因素，如年齡、性別、病毒感染和疾病的所處階段。以后應(yīng)檢測(cè)更多的包括HCC各階段的樣本來(lái)提高血清外泌體miRNAs測(cè)定結(jié)果的可靠性，使其真正成為HCC診斷及預(yù)后評(píng)估的穩(wěn)定、準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物。

最后在其用于HCC治療方面：正如前文所述，外泌體miRNAs介導(dǎo)的HCC治療首先應(yīng)保證足夠數(shù)量和優(yōu)質(zhì)質(zhì)量的外泌體；此外，將所期望的miRNAs結(jié)合到外泌體中仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。除將表達(dá)過(guò)量miRNAs的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至供體細(xì)胞外[27]，也可通過(guò)電穿孔方式實(shí)現(xiàn)將miRNAs轉(zhuǎn)至外泌體中[30]；另一個(gè)有待解決的關(guān)鍵問(wèn)題是如何提高受體細(xì)胞攝取包含所需miRNAs外泌體的能力。相關(guān)研究表明，在轉(zhuǎn)染液泡分選蛋白4A(Vps4A)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞中，6種抑制腫瘤miRNAs顯著上調(diào)，Vps4A增強(qiáng)了HCC細(xì)胞中外泌體對(duì)腫瘤抑制miRNAs的攝取[31]。總之，外泌體miRNAs用于HCC治療前景廣闊，但臨床應(yīng)用尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，外泌體miRNAs不僅有助于HCC的早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)，還可作為一種新的治療模式。但目前對(duì)外泌體miRNAs的相關(guān)研究仍處于探索階段，為更全面地弄清外泌體miRNAs與HCC的關(guān)系尚需更深層次的研究。隨著外泌體miRNAs研究的不斷深入，其在HCC的診治及預(yù)后評(píng)估中將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。