蔡治方，彭慈軍，傲宇，兌丹華，蘭天罡

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，貴州 遵義 563000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是臨床中常見的急腹癥之一，其病理特征為胰腺間質(zhì)出現(xiàn)水腫、出血，腺泡細(xì)胞發(fā)生空泡變性、壞死或炎癥細(xì)胞大量浸潤[1]。AP因其臨床結(jié)局難以預(yù)料，嚴(yán)重威脅患者健康。清胰Ⅱ號是遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)典中藥方劑，盡管許多研究表明其對AP療效顯著，但是作用機(jī)制仍不完全明確[2]。為進(jìn)一步探討清胰Ⅱ號對AP的治療機(jī)制，本研究利用3%?；悄懰徕c經(jīng)膽胰管逆行注射復(fù)制AP大鼠模型，觀察清胰Ⅱ號灌胃對AP大鼠的胰腺保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

36只清潔級SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK-（軍）201802154，雌雄不限制，體重210～265 g，平均（238±28）g。

1.2 實驗藥物

清胰Ⅱ號（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科自制），濃度250 mg/ml。

1.3 試劑與儀器

牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司），大鼠腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）ELISA 試劑盒（上海齊一生物科技有限公司，QY-H10038），大鼠白細(xì)胞介素6（Interleukin 6, IL-6）ELISA 試劑盒（上海易匯生物科技有限公司，ab87933），大鼠白細(xì)胞介素1β（Interleukin 1β, IL-1β）ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，AZ-003），iMARK 680通用酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定、組織線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物公司，總RNA抽提試劑Trizol、dNTP、Oligo（dT）15、Taq DNA聚合酶、一抗、二抗購自上?？迫A生物工程股份有限公司，組織活性氧（DHE-ROS）檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司），引物設(shè)計由上海生工生物工程有限公司完成，TNF-α正向引物：5'-TTCTGTCTACTGAACTTC GGGGTGATCGGTCC-3'，反向引物：5'-GTATGAGA TAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG-3'；IL-6正向引物：5'-TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC-3'，反向引物：5'-GTGTAATTAAGCCTCCGACTTG-3'；IL-1β 正向引物：5'-GAAAGACGGCACACCCACCCT-3'，反向引物：5'-GCTCTGCTTGTGAGGTGCTGATGTA-3'；GAPDH正向引物：5'-CATGACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向引物：5'-TGAGGTCCACCACCCTGTTGCTGT-3'。

1.4 實驗分組與模型的復(fù)制

根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和干預(yù)組，每組12只。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛（0.33 ml/100 g）麻醉后，取上腹部正中切口進(jìn)入腹腔，假手術(shù)組大鼠開腹后僅翻動腸管，隨后關(guān)腹；模型組和干預(yù)組大鼠在顯露膽胰管后，采用小動脈夾暫時阻閉膽管，由十二指腸前壁斜行進(jìn)針經(jīng)乳頭部插入膽胰管后，勻速逆行向膽胰管內(nèi)注入3%?；悄懰徕c（0.1 ml/100 g），夾閉膽胰管進(jìn)入十二指腸的開口2 min，隨后松開小動脈夾，關(guān)腹。放入代謝籠自由飲水、禁食。

1.5 方法

1.5.1 處理方法 模型復(fù)制后，干預(yù)組大鼠給予清胰Ⅱ號灌胃（1 ml/100 g），模型組和假手術(shù)組大鼠給予生理鹽水（1 ml/100 g）灌胃，各組灌胃6 h/次，連續(xù)4次。

1.5.2 TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平檢測 采用ELISA雙抗體夾心法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平。所有大鼠處理24 h后，沿原切口進(jìn)入腹腔，于下腔靜脈取血3～5 ml，迅速冰上3 000 r/min離心15 min，仔細(xì)收集上清液。采用TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。方法如下：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔10孔，加樣量均為50μl（根據(jù)不同試劑盒要求進(jìn)行稀釋濃度），同時設(shè)置不加樣品和酶標(biāo)試劑的空白對照孔，待測樣品孔中加入最終稀釋5倍的樣品，混勻后于37℃溫育30 min，隨后小心棄去液體，向每孔中加入洗滌液，靜置30 s后棄去液體，重復(fù)5次后，加入辣根過氧化物酶試劑50μl/孔，混勻后于37℃溫育30 min后洗滌，按順序加入顯色劑A、B各50μl/孔，震蕩混勻后避光顯色15 min，加入50μl終止液，于450 nm波長處測定光密度（OD）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平。

1.5.3 胰腺病理評分檢測 取胰腺組織約3 mm×3 mm×3 mm，10%甲醛固定3 h后脫水，透明、浸蠟、包埋，冷凍30 min后切片、攤烤片、脫蠟、蘇木精染色10 min，分化、復(fù)染、脫水、透明后封固，做病理學(xué)檢查，按改良的Schmidt標(biāo)準(zhǔn)法聯(lián)合Rongione法做胰腺病理評分，取3張非連續(xù)切片中3個隨機(jī)視野進(jìn)行病理評分，以各評分平均值作為最終胰腺病理評分。

1.5.4 TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水 平 檢 測采用RT-PCR檢測TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水平。取胰腺組織剪碎后冰上勻漿，在EP管中加入氯仿200μl于勻漿液中，震蕩混勻，4℃、12 000 r/min離心，取上層液加入等量異丙醇，混勻后繼續(xù)4℃、12 000 r/min離心，提取沉淀物。紫外分光光度計檢測純度。將上述引物各0.25μl加入5×buffer液5μl、Ex Taq 0.125μl、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液5μl，用滅菌三蒸水調(diào)至25.5μl。PCR擴(kuò)增條件：94℃變性1 min，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。取產(chǎn)物5μl電泳，以GAPDH為參照，分析灰度值。

1.5.5 核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）核轉(zhuǎn)位水平檢測 采用SABC免疫組織化學(xué)法檢測NF-κB核轉(zhuǎn)位水平，取胰腺組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行脫蠟、水化，以3%雙氧水去過氧化物酶封閉，加入抗NF-κB多克隆抗體（1∶100）、生物素化羊抗鼠IgG、SABC復(fù)合物，孵育后DAB染色、復(fù)染、封片。陰性對照以PBS代替一抗。每只大鼠選取5張切片，每張切片隨機(jī)選取2個高倍鏡視野觀察，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為NF-κB陽性細(xì)胞。

1.5.6 胰腺組織活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）水平檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺組織ROS水平，剪取胰腺組織50 mg左右，PBS清洗后于冰上加入線粒體分離試劑A（100μl/10 mg）勻漿8～12次，4℃、3 000 r/min離心5 min，收集上清液后繼續(xù)4℃、3 000 r/min離心5 min，沉淀物即為線粒體，按1∶20加入勻漿介質(zhì)，低溫勻漿10 min，收集上清液，加入DCFH-DA工作液1 mmol，混勻后37℃溫育30 min，流式細(xì)胞儀測定ROS水平。

1.5.7 Western blotting檢測 采用Western blotting檢測磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase, p-JNK, p-JNK）和總c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）水平。取胰腺組織剪碎后勻漿，加入裂解液裂解約30 min后低溫離心，測定蛋白質(zhì)濃度，配置12%分離膠，取10μl樣品上樣，在80～120 V電壓下進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜后加入一抗，4℃過夜。加入二抗后，37℃搖床中孵育1.5 h，進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胰腺病理評分比較

假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組胰腺病理評分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組胰腺病理評分低于模型組（P＜0.05），模型組胰腺病理評分高于假手術(shù)組（P＜0.05），說明模型復(fù)制成功，清胰Ⅱ號干預(yù)效果明顯，可以用于后續(xù)研究。見表1和圖1。

2.2 各組大鼠NF-κB核轉(zhuǎn)位水平比較

假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組胞漿NF-κB水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組胞漿NF-κB水平低于假手術(shù)組（P＜0.05），但高于模型組（P＜0.05）。假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組胞核NF-κB水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組胞核NF-κB水平高于假手術(shù)組（P＜0.05），但低于模型組（P＜0.05）。假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組NF-κB核轉(zhuǎn)位率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組NF-κB核轉(zhuǎn)位率低于假手術(shù)組和模型組（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組TNF-α蛋白和mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組TNF-α蛋白和mRNA水平低于模型組（P＜0.05），但高于假手術(shù)組（P＜0.05）。假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組IL-6蛋白和mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組IL-6蛋白和mRNA水平低于模型組（P＜0.05），但高于假手術(shù)組（P＜0.05）。假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組IL-1β蛋白和mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），干預(yù)組IL-6蛋白和mRNA水平低于模型組（P＜0.05），但高于假手術(shù)組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠胰腺病理評分、NF-κB核轉(zhuǎn)位水平比較 （n =12，±s）

表1 各組大鼠胰腺病理評分、NF-κB核轉(zhuǎn)位水平比較 （n =12，±s）

組別 胰腺病理評分NF-κB核轉(zhuǎn)位水平胞漿NF-κB/（×102個） 胞核NF-κB/（×102個） NF-κB核轉(zhuǎn)位率/%假手術(shù)組 0.00±0.00 0.66±0.52 0.05±0.02 59.69±3.08模型組 13.17±0.72 0.42±0.05 0.20±0.02 33.37±3.53干預(yù)組 10.08±0.90 0.47±0.05 0.16±0.02 29.52±4.58 F值 1287.754 71.185 196.843 225.602 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 各組大鼠胰腺組織病理切片圖 （HE×100）

表2 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 （n =12，±s）

表2 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 （n =12，±s）

組別TNF-α IL-6 IL-1β蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA假手術(shù)組 6.43±1.01 2.30±0.41 1.20±0.25 3.61±1.86 23.65±7.05 44.55±10.85模型組 25.57±8.43 38.06±14.66 5.81±1.74 27.85±10.22 59.16±14.90 67.44±10.59干預(yù)組 18.51±8.53 22.36±10.65 2.28±1.33 11.13±4.27 34.60±14.07 57.73±9.64 F值 23.275 35.223 43.163 43.932 25.349 14.711 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 各組大鼠ROS、p-JNK、JNK水平比較

假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組ROS、p-JNK、JNK蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組ROS、p-JNK、JNK蛋白水平低于模型組（P＜0.05），但高于假手術(shù)組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠ROS、p-JNK、JNK水平比較（n =12，±s）

表3 各組大鼠ROS、p-JNK、JNK水平比較（n =12，±s）

組別 ROS p-JNK JNK假手術(shù)組 11.64±6.42 6.41±2.85 7.04±3.39模型組 85.99±13.53 34.82±6.64 44.40±9.40干預(yù)組 41.85±11.38 13.89±4.23 18.04±9.31 F值 142.299 111.236 41.180 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

目前，越來越多的研究表明，ROS導(dǎo)致的JNK信號通路激活在AP的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色[3-4]，而一系列炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等是導(dǎo)致AP惡化的主要因素[5]。同時，課題組前期研究結(jié)果表明，清胰Ⅱ號對AP動物模型的療效較好[6-8]，然而其是否通過抑制ROS/JNK通路導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)仍不清楚。因此，筆者在以往研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察清胰Ⅱ號對AP大鼠的治療作用，并且對其可能的機(jī)制進(jìn)行探討。

研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組胰腺病理評分低于干預(yù)組，干預(yù)組胰腺病理評分低于模型組，提示清胰Ⅱ號對AP大鼠胰腺具有一定的保護(hù)作用，與以往研究結(jié)果一致[2，6-8]。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組NF-κB核轉(zhuǎn)位率高于假手術(shù)組；干預(yù)組NF-κB核轉(zhuǎn)位率高于假手術(shù)組，但低于模型組。NF-κB在正常細(xì)胞中以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞漿，當(dāng)細(xì)胞受到特定刺激時，NF-κB迅速從細(xì)胞漿易位到細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控炎癥級聯(lián)瀑布反應(yīng)相關(guān)酶等基因的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。由此可見，NF-κB必須發(fā)生核轉(zhuǎn)位才可以啟動下游炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，因此本研究以NF-κB核轉(zhuǎn)位率評價其在AP大鼠中的活化。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)大鼠發(fā)生AP時，NF-κB核轉(zhuǎn)位率增加，應(yīng)用清胰Ⅱ號干預(yù)后，NF-κB核轉(zhuǎn)位率得到明顯抑制。為探討其下游炎癥因子是否受到抑制，本實驗繼續(xù)觀察TNF-α、IL-6、IL-1β水平，結(jié)果顯示，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于假手術(shù)組，干預(yù)組上述指標(biāo)高于假手術(shù)組，但低于模型組。這一結(jié)果與NF-κB核轉(zhuǎn)位率的變化互相印證，說明清胰Ⅱ號能夠通過抑制AP大鼠NF-κB核轉(zhuǎn)位率，進(jìn)而抑制其下游炎癥因子的表達(dá)，最終起到保護(hù)胰腺的作用。

目前研究表明，ROS與JNK相互作用可導(dǎo)致細(xì)胞炎癥的發(fā)生、發(fā)展[3，9]。因此，本研究選取ROS/JNK作為機(jī)制研究的觀察目標(biāo)。結(jié)果顯示，模型組ROS、p-JNK、JNK水平高于假手術(shù)組，干預(yù)組上述指標(biāo)高于假手術(shù)組，但低于模型組。這提示清胰Ⅱ號可能通過抑制ROS、JNK，進(jìn)而減少細(xì)胞炎癥的發(fā)生。但由于ROS與JNK的作用關(guān)系較為復(fù)雜，在多數(shù)情況下，JNK接受上游ROS調(diào)控，ROS促進(jìn)LNK的激活[10]。但也有學(xué)者報道，ROS產(chǎn)生生物活性的前提是JNK的存在，或者需要JNK的活化[11-12]。目前關(guān)于兩者間的作用關(guān)系尚未達(dá)成一致，因此清胰Ⅱ號抑制AP大鼠ROS、JNK表達(dá)的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，清胰Ⅱ號對AP大鼠的胰腺保護(hù)作用機(jī)制可能是通過下調(diào)NF-κB及ROS/JNK通路，降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平從而發(fā)揮作用，但由于NF-κB、ROS及JNK間存在復(fù)雜關(guān)系，對于清胰Ⅱ號治療AP的機(jī)制研究仍任重道遠(yuǎn)。