藺廣榮，劉克毅，李紀(jì)男，何轉(zhuǎn)麗，霍建平，柴芳

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 甲狀腺外科，遼寧 錦州 121001）

近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率快速上升，成為最常見的惡性腫瘤之一[1]。其中甲狀腺濾泡癌（follicular thyroid carcinoma, FTC）是繼甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma, PTC）之后的常見甲狀腺癌，約占10%，轉(zhuǎn)運(yùn)途徑以血運(yùn)轉(zhuǎn)移為主，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其侵襲性、轉(zhuǎn)移率及病死率均高于PTC[2]。根據(jù)侵襲程度分為廣泛侵入型甲狀腺濾泡癌（widely invasive follicular thyroid carcinoma, WIFTC）和微小侵入型甲狀腺濾泡癌（minimally invasive follicular thyroid carcinoma, MIFTC），兩者預(yù)后差異明顯[3]。熱休克蛋白A9（heat shock protein, HSPA9）是一種高度保守的分子伴侶蛋白，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[4]。Beclin-1屬于自噬相關(guān)蛋白，在細(xì)胞的自噬過程中起著重要的調(diào)控作用。筆者擬對HSPA9、Beclin-1蛋白在FTC中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，對其臨床病理意義進(jìn)行探討，同時(shí)分析兩者在FTC中表達(dá)的相關(guān)性，為臨床尋求新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2000年1月—2017年12月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的FTC患者57例，取其癌組織及其癌旁組織（距病灶≤2 cm）。其中，男性18例，女性39例；年齡22～72歲，平均（49.5±18.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷由2位高年資的病理醫(yī)生共同確診；②無甲狀腺癌家族遺傳史；③術(shù)前未行內(nèi)分泌治療及放化療；④無合并橋本氏病等甲狀腺相關(guān)疾??；⑤臨床分期按照2010年美國癌癥聯(lián)合會分期。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)SABC法。組織經(jīng)10%甲醛固定后脫水、包埋，切片厚度4μm，檢測HSPA9、Beclin-1蛋白表達(dá)。一抗均按1∶100稀釋，按試劑盒說明書操作，微波修復(fù)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，之后進(jìn)行血清封閉。依次加入一抗、二抗及SABC，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。PBS取代一抗作為陰性對照。

1.3 主要試劑

兔抗人HSPA9（WL03209）、兔抗人Beclin-1（WL02237）單克隆抗體及即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法獨(dú)立閱片。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比來評分。HSPA9及Beclin-1染色部位均為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。以出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀為陽性表達(dá)。強(qiáng)度評分為0（無染色）、1（淺黃色）、2（棕黃色）及3分（棕褐色）。比例積分為0（＜5%陽性細(xì)胞）、1（5%～＜25%陽性細(xì)胞）、2（25%～＜50%陽性細(xì)胞）、3（50%～＜75%陽性細(xì)胞）和4分（75%陽性細(xì)胞）。強(qiáng)度評分和比例積分相乘產(chǎn)生最終的染色評分：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽性（+）；5～8分為陽性（++）；9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，（-）或（+）最后染色評分被合并為陰性表達(dá)，（++）或（+++）最后評分被合并為陽性表達(dá)。見圖1、2。

圖1 FTC組織中HSPA9和Beclin-1的表達(dá)（SABC×400）

圖2 癌旁組織中HSPA9和Beclin-1的表達(dá)（SABC×400）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，等級相關(guān)分析采用Spearman法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTC及其癌旁組織中HSPA9、Beclin-1蛋白陽性表達(dá)率比較

FTC組織中HSPA9陽性表達(dá)43例（75.44%），癌旁組織中HSPA9陽性表達(dá)9例（15.79%），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=40.876，P=0.000）。FTC組織中Beclin-1陽性表達(dá)35例（61.40%），癌旁組織中Beclin-1陽性表達(dá)10例（17.54%），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.947，P=0.000）。

2.2 HSPA9、Beclin-1蛋白表達(dá)與FTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同病理類型、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的HSPA9陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同病理類型患者的Beclin-1陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

2.3 FTC組織中HSPA9與Beclin-1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

FTC組織中HSPA9與Beclin-1共同陽性34例，共同陰性13例，HSPA9陽性而Beclin-1陰性9例，HSPA9陰性而Beclin-1陽性1例。HSPA9與Beclin-1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.636，P=0.000）。

附表 HSPA9、Beclin-1蛋白表達(dá)與FTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例（%）

3 討論

自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)分解代謝過程，在營養(yǎng)缺乏、缺氧和DNA損傷的情況下，激活細(xì)胞自噬以促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)組分的降解[5]。目前越來越多的文獻(xiàn)支持自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用[6-7]。自噬相關(guān)蛋白在參與調(diào)節(jié)自噬的啟動、延長和成熟的過程中發(fā)揮重要作用。Beclin-1是自噬通路的重要調(diào)節(jié)器，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1在FTC中陽性表達(dá)35例（61.40%），癌旁組織中陽性表達(dá)10例（17.54%），兩者比較有差異，進(jìn)而推測自噬參與FTC的發(fā)生，這一點(diǎn)與既往研究一致[8]。本研究還發(fā)現(xiàn)27例WIFTC患者中Beclin-1陽性表達(dá)22例（81.48%），30例MIFTC患者中Beclin-1陽性表達(dá)13例（43.33%），兩者比較有差異，提示自噬可能參與FTC的發(fā)展。筆者推測腫瘤的生存狀態(tài)與自噬密切程度有關(guān)。隨著腫瘤侵襲力的增強(qiáng)，自噬可能幫助腫瘤細(xì)胞擺脫應(yīng)激環(huán)境，來促進(jìn)腫瘤的生長。盡管沒有發(fā)現(xiàn)Beclin-1的表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，但是筆者考慮主要與納入的研究對象例數(shù)有關(guān)。有研究表明，自噬是髓樣癌腫瘤細(xì)胞的生存機(jī)制[9]。也有學(xué)者認(rèn)為，自噬活性的下降與PTC的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[10]。筆者認(rèn)為自噬在不同病理類型的甲狀腺癌中的發(fā)病機(jī)制可能不同。目前自噬相關(guān)蛋白在FTC中研究較少，還需要更多的研究驗(yàn)證自噬在FTC中的發(fā)病機(jī)制。

HSPA9是熱休克蛋白70的家族成員之一，在細(xì)胞周期調(diào)控方面起著重要作用[11-12]。本研究選取18例有轉(zhuǎn)移的FTC患者，結(jié)果陽性率為100%。HSPA9在27例WIFTC患者中陽性表達(dá)25例（92.59%），30例MIFTC患者中陽性表達(dá)18例（60.00%），兩者比較有差異。筆者推測，HSPA9在FTC侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色。STARENKI等[13]用免疫組織化學(xué)法檢測46例正常甲狀腺組織和38例甲狀腺髓樣癌患者組織中HSPA9的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，認(rèn)為HSPA9可作為甲狀腺髓樣癌的一個(gè)新治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，HSPA9在癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，筆者認(rèn)為HSPA9也可作為FTC的治療靶點(diǎn)?？祻?qiáng)等[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過siRNA沉默HSPA9表達(dá)可抑制人肝癌細(xì)胞HCCLM3增殖活性，認(rèn)為HSPA9可以作為肝細(xì)胞癌潛在的治療靶點(diǎn)。ANDO等[15]發(fā)現(xiàn)，HSPA9不僅可作為胃癌的治療靶點(diǎn)，而且是一個(gè)很好的評估胃癌預(yù)后的分子。HSPA9參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并有望成為多種腫瘤的治療靶點(diǎn)。

HSPA9可通過Raf/Mek/Erk1/2信號通路來促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)[16]。Bcl-2蛋白通過與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1共有的BH3結(jié)構(gòu)域相互作用，參與自噬的調(diào)控[17]。筆者推測，HSPA9可能通過Raf/Mek/Erk1/2信號通路調(diào)節(jié)自噬活性，并參與FTC的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，HSPA9通過PI3K-Akt和JAK-STAT信號通路加速乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)，HSPA9通過MAPK-ERK信號通路參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展[19]。由此可見，HSPA9參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。

綜上所述，本研究提示HSPA9和Beclin-1蛋白可能與FTC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為FTC提供新的治療靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。