王曉庚，劉 林，左 健，張非煜，李若萱

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院口腔科， 北京 100029)

口腔鱗癌是發(fā)生于頭頸部的常見惡性腫瘤，目前以手術(shù)治療和放化療等為主要治療手段，這些治療方法取得了一定的效果，但是中晚期的口腔鱗癌患者生存率仍然不高，因此探討口腔鱗癌發(fā)病機制，尋找靶基因提高口腔鱗癌患者生存率是目前的重點[1-2]。叉頭框蛋白M1 (forkhead box protein M1, FoxM1)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在增殖活性較高的細胞中高表達，而在靜止期的細胞中表達水平極低，參與胚胎發(fā)育、成人組織自我更新、細胞增生等過程，具有抗衰老和促進損傷修復(fù)等作用[3]。目前在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)FoxM1高表達，F(xiàn)oxM1具有促進腫瘤生長作用，F(xiàn)oxM1表達升高的腫瘤主要有前列腺癌、肺癌、口腔鱗癌和血液系統(tǒng)腫瘤等，F(xiàn)oxM1表達水平的高低與腫瘤患者分期和分級等有關(guān)[4-5]。目前在宮頸癌、喉癌和乳腺癌等癌細胞中已經(jīng)證實，沉默F(xiàn)oxM1表達具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用，而其在口腔鱗癌細胞凋亡中的作用尚不清楚[6-8]。本實驗通過沉默口腔鱗癌SCC9細胞中FoxM1的表達，探討其在口腔鱗癌細胞凋亡中的作用，以期為靶向基因治療口腔鱗癌提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

胞漿蛋白提取試劑盒和線粒體蛋白提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；FoxM1-shRNA慢病毒和陰性對照慢病毒由漢恒生物技術(shù)(上海)有限公司構(gòu)建包裝；RevertAid 第一鏈cDNA Synthesis試劑盒和Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自Thermo Scientifc；抗細胞色素C(cytochrome C)、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9抗體購自Abcam；口腔鱗癌SCC9細胞購自湖南豐暉生物科技有限公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1細胞感染及沉默效果檢測 SCC9細胞感染攜帶綠色熒光蛋白的FoxM1-shRNA慢病毒或陰性對照慢病毒(MOI=20)。SCC9細胞培養(yǎng)密度約為30%時，添加病毒液，感染10 h后，更換細胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)3 d后綠色熒光表達情況，感染效率高于70%，進行嘌呤霉素篩選，篩選穩(wěn)定感染的細胞做后續(xù)實驗。把感染FoxM1-shRNA慢病毒和陰性對照慢病毒后的SCC9細胞記為Lv-FoxM1-shRNA和Lv-control，把沒有感染病毒的細胞作為control。用RT-qPCR和Western blot測定沉默效果。

RT-qPCR檢測：各組細胞中添加PBS洗滌后，加入TRIzol裂解液，將細胞吹打至勻漿狀態(tài)以后，轉(zhuǎn)移到離心管中，添加200 μL的氯仿，振蕩反應(yīng)15 s后，在冰上孵育10 min。12 000×g離心10 min。吸取上清500 μL，加入預(yù)冷的異丙醇，混合振蕩30 s，冰浴5 min。12 000×g離心10 min。把上清吸除，添加75%乙醇洗滌后，在室溫中晾干。RNA樣品的A260/A280在1.8～2.0之間。用RevertAid 第一鏈cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA。取cDNA，進行qPCR。PCR引物由上海生工合成。FoxM1的上游序列為5’-GGAGGAAATGCCACACTTAGCG-3’，下游引物序列為5’-TAGGACTTCTTGGGTCTTGGGGTG-3’;β-actin的上游引物序列為5’-CCACATGTGCCCATCTACG-3’,下游引物序列為5’-AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3’。PCR步驟同Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，反應(yīng)結(jié)束后讀取每個反應(yīng)的Ct值，以β-actin作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計算分析FoxM1表達變化。

Western blot檢測：各組細胞中添加蛋白裂解液(每106個細胞中加入50 μL蛋白裂解液)，混合后，在冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000×g離心10 min。把上清溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，吸取2 μL的蛋白測定濃度。在蛋白樣品中加入1/4體積的5×Loading Buffer，在沸水中反應(yīng)5 min。采用5%的濃縮膠和10%的分離膠進行電泳，每個上樣孔中加入30 μg的蛋白樣品，分離膠中75 V電泳40 min，濃縮膠中110 V電泳80 min。電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜的電壓設(shè)置為100 V，轉(zhuǎn)膜時間為100 min。將電轉(zhuǎn)移后的NC膜放在5%脫脂奶粉中封閉2 h后，進行抗原抗體反應(yīng)，Ⅰ抗以1∶400稀釋，Ⅱ抗以1∶3 000稀釋。用ECL顯色。根據(jù)每組蛋白條帶的吸光度值分析蛋白表達水平，內(nèi)參照為β-actin。

2.2MTT測定細胞活力 各組細胞制成濃度為3×107/L的單細胞懸浮液，鋪板，每個96孔板中加入100 μL的單細胞懸浮液，分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d和4 d后取出培養(yǎng)板，在每個孔內(nèi)添加MTT，孵育4 h以后，棄上清，用DMSO將結(jié)晶溶解以后，測定490 nm每孔的A值，同時以空白孔調(diào)零，分析細胞活力。

2.3克隆形成實驗測定細胞克隆能力 各組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化以后，配制成單細胞懸浮液，在每個6孔板中加入100個細胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3周，觀察出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，期間每間隔2 d觀察1次細胞克隆形成情況，當(dāng)觀察到肉眼可見的細胞克隆形成時，終止培養(yǎng)。PBS洗滌3次，甲醇固定20 min，結(jié)晶紫染色。觀察≥50個細胞的克隆數(shù)目?？寺⌒纬陕?%)=克隆細胞數(shù)目/接種細胞數(shù)目×100%。

2.4流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 各組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化以后，配制成單細胞懸浮液，細胞密度為3×109/L。吸取1 mL的細胞懸浮液，離心后，收集細胞沉淀，用PBS懸浮洗滌2次以后，添加400 μL的結(jié)合緩沖液，再依次加入PI和Annexin V-FITC染液各5 μL，孵育結(jié)合20 min后，用流式細胞儀檢測凋亡變化。

2.5Western blot測定細胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平 取各組細胞，用Western blot方法檢測細胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平，以β-actin作為內(nèi)參照，分析蛋白表達變化。

2.6線粒體膜電位及胞漿、線粒體中cytochrome C蛋白水平檢測 取各組細胞，用JC-1染色法檢測線粒體膜電位變化，結(jié)果用紅色熒光與綠色熒光的比值表示，步驟同試劑盒說明書。同時提取細胞線粒體和胞漿中的蛋白，用Western blot方法檢測cytochrome C蛋白水平，線粒體中cytochrome C蛋白水平變化用VDCA1作為內(nèi)參照，胞漿中cytochrome C蛋白水平變化用β-actin作為內(nèi)參照，Western blot步驟同上，胞漿和線粒體蛋白提取步驟同胞漿和線粒體蛋白提取試劑盒。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FoxM1-shRNA可以明顯下調(diào)口腔鱗癌細胞中FoxM1的表達水平

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1-sh-RNA慢病毒感染可以顯著下調(diào)口腔鱗癌細胞中FoxM1 mRNA和蛋白水平(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1.FoxM1-shRNA down-regulated the level of FoxM1 protein in oral squamous-cell carcinoma cells.

圖1FoxM1-shRNA下調(diào)口腔鱗癌細胞中FoxM1的蛋白水平

表1FoxM1-shRNA對口腔鱗癌細胞中FoxM1蛋白和mRNA表達水平的影響

Table 1.Effect of FoxM1-shRNA on FoxM1 protein and mRNA expression in oral squamous-cell carcinoma cells (Mean±SD.n=3)

GroupFoxM1 proteinFoxM1 mRNAControl0.45±0.041.00Lv-control0.47±0.051.04±0.10Lv-FoxM1-shRNA0.20±0.02?0.39±0.05?

*P<0.05vscontrol and Lv-control groups.

2 沉默F(xiàn)oxM1下調(diào)口腔鱗癌細胞活力

沉默F(xiàn)oxM1的口腔鱗癌細胞在490 nm的A值明顯降低(P<0.05),說明沉默F(xiàn)oxM1顯著下調(diào)口腔鱗癌細胞活力，見表2。

表2 沉默F(xiàn)oxM1降低口腔鱗癌細胞活力

*P<0.05vscontrol and Lv-control groups.

3 沉默F(xiàn)oxM1可明顯降低口腔鱗癌細胞克隆形成能力

沉默F(xiàn)oxM1的口腔鱗癌細胞克隆形成率降低(P<0.05),說明沉默F(xiàn)oxM1可降低口腔鱗癌細胞的克隆形成能力,見表3。

4 沉默F(xiàn)oxM1可以明顯誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞凋亡

如圖2和表4中所示，沉默F(xiàn)oxM1的口腔鱗癌細胞凋亡率升高(P<0.05)，細胞中caspase-3和caspase-9活化水平升高(P<0.05)，說明沉默F(xiàn)oxM1可激活caspase-3和caspase-9，并誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞凋亡。

表3沉默F(xiàn)oxM1降低口腔鱗癌細胞克隆形成能力

Table 3.Silencing ofFoxM1decreased the colony-forming ability of oral squamous-cell carcinoma cells (Mean±SD.n=3)

GroupColony formation rate (%)Control38.56±3.26Lv-control39.54±2.35Lv-FoxM1-shRNA20.16±1.25?

*P<0.05vscontrol and Lv-control groups.

Figure 2.Silencing ofFoxM1 activated caspase-3 and caspase-9 to induce the apoptosis of oral squamous-cell carcinoma cells. A: apoptosis was measured by flow cytometry; B: Western blot was used to measure the levels of cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 protein.

圖2沉默F(xiàn)oxM1激活caspase-3和caspase-9誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞凋亡

表4沉默F(xiàn)oxM1誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞凋亡及caspase-3和caspase-9活化

Table 4.Silencing ofFoxM1 induced the apoptosis and activation of caspase-3 and caspase-9 in oral squamous-cell carcinoma cells(Mean±SD.n=3)

GroupApoptotic rate (%)Cleaved caspase-3Cleaved caspase-9Control3.64±0.320.15±0.020.16±0.01Lv-control3.85±0.540.13±0.010.18±0.02Lv-FoxM1-shRNA26.63±3.52?0.28±0.03?0.35±0.03?

*P<0.05vscontrol and Lv-control groups.

5 沉默F(xiàn)oxM1降低口腔鱗癌細胞線粒體膜電位并促進線粒體釋放cytochrome C

如圖3和表5中所示，沉默F(xiàn)oxM1的口腔鱗癌細胞線粒體膜電位降低(P<0.05)，胞漿中cytochrome C蛋白水平升高(P<0.05)，線粒體中cytochrome C蛋白水平降低(P<0.05)，說明沉默F(xiàn)oxM1能夠降低口腔鱗癌細胞線粒體膜電位，促進線粒體釋放cytochrome C。

討 論

FoxM1蛋白包含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、核定位序列和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其表達水平的高低與細胞增殖活躍程度有關(guān)[9]。FoxM1在胚胎組織中的表達水平普遍較高，具有促進神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肺臟發(fā)育等作用，F(xiàn)oxM1在成人增生細胞或自我更新組織中的表達水平較高，具有抗衰老和促進損傷修復(fù)等作用[10-11]。FoxM1是一種促增殖轉(zhuǎn)錄因子，受到細胞內(nèi)多種癌基因和抑癌基因的調(diào)控作用，參與腫瘤的發(fā)生、生長和進展，與腫瘤細胞的增殖、凋亡和分化等有關(guān)，沉默F(xiàn)oxM1具有降低食管癌和卵巢癌等腫瘤細胞增殖能力等作用[12-14]。研究表明，F(xiàn)oxM1在口腔鱗癌組織中表達水平異常升高[15]。本實驗顯示，F(xiàn)oxM1沉默后的口腔鱗癌細胞活力降低，克隆形成能力也降低，說明沉默F(xiàn)oxM1具有抑制口腔鱗癌細胞生長的作用。

Figure 3.Silencing ofFoxM1 promoted cytochrome C release from mitochondria of oral squamous-cell carcinoma cells. A: Western blot was used to determine the level of cytochrome C protein in the cytoplasm; B: Western blot was used to determine cytochrome C protein level in mitochondria.

圖3沉默F(xiàn)oxM1促進口腔鱗癌細胞線粒體釋放cytochromeC

表5沉默F(xiàn)oxM1促進口腔鱗癌細胞線粒體釋放cytochromeC，降低線粒體膜電位

Table 5.Silencing ofFoxM1 promoted the release of cytochrome C from mitochondria and decreased the mitochondrial membrane potential in oral squamous-cell carcinoma cells (Mean±SD.n=3)

GroupCytochrome C(Cytoplasm)Cytochrome C(Mitochondria)Mitochondrial membrane potentialControl0.09±0.020.26±0.035.15±0.63Lv-control0.08±0.010.25±0.025.28±0.82Lv-FoxM1-shRNA0.21±0.03?0.14±0.02?2.56±0.45?

*P<0.05vscontrol and Lv-control groups.

細胞凋亡是受到基因調(diào)控作用的細胞死亡，目前的研究認為，細胞凋亡的發(fā)生受到caspase級聯(lián)反應(yīng)的高度調(diào)控作用，caspase-3是該級聯(lián)反應(yīng)的下游效應(yīng)子，其可以將細胞內(nèi)的底物降解誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生，caspase-3被認為是凋亡執(zhí)行者[16]。Caspase-3以酶原的形式合成后，必須受到起始型caspase成員激活才可以發(fā)揮凋亡促進作用[17]。Caspase-9和cytochrome C等形成的復(fù)合物是caspase-3激活的誘導(dǎo)因素之一，也是目前研究的與細胞凋亡有關(guān)的線粒體凋亡途徑。細胞在受到活性氧和ATP等刺激以后，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔被打開，導(dǎo)致線粒體內(nèi)外的H+濃度梯度和線粒體內(nèi)外的滲透壓被破壞，使原本存在于線粒體內(nèi)的cytochrome C釋放至胞漿中，cytochrome C可以同caspase-9結(jié)合促進細胞凋亡的發(fā)生[18-20]。本實驗的結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxM1后的口腔鱗癌細胞中線粒體膜電位降低，caspase-3和caspase-9活化水平升高，胞漿中cytochrome C蛋白水平升高，線粒體中cytochrome C蛋白水平降低，線粒體膜電位降低，提示沉默F(xiàn)oxM1可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞凋亡。

目前對于FoxM1調(diào)控腫瘤細胞凋亡機制研究尚不清楚，在鼻咽癌中的研究顯示，F(xiàn)oxM1沉默可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡，在喉癌細胞中的研究也顯示，沉默F(xiàn)oxM1可以降低線粒體膜電位并激活caspase-9，這與本實驗結(jié)果相符合，均提示沉默F(xiàn)oxM1可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[21-23]。也有研究報道顯示，F(xiàn)oxM1還可以通過調(diào)控JNK信號通路的傳導(dǎo)影響腫瘤細胞生長，F(xiàn)oxM1可能是p53下游靶基因[24-25]。本實驗沒有探討FoxM1與JNK信號通路、p53等多種信號之間的調(diào)控作用，在后續(xù)實驗中會進行深入研究。

綜上所述，沉默F(xiàn)oxM1具有誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞凋亡作用，其作用機制與激活線粒體凋亡途徑有關(guān)。這為靶向FoxM1治療口腔鱗癌提供了依據(jù)，為闡明FoxM1在口腔鱗癌發(fā)生中的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。