徐 南，徐 杰，李 函，錢麗娟，李忠堂

(1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院無錫分院兒科， 江蘇 無錫 214011； 2東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院兒科， 江蘇 南京 210009)

血管瘤是一種常發(fā)生于嬰幼兒的良性腫瘤，主要的病理表現(xiàn)為血管的惡性形成，生物學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(hemangioma endothelial cells, HemECs)的異常增生，具有明顯的增生期和退化期[1-2]。雖然部分血管瘤可自行消退，但仍有部分血管瘤未退化并可進(jìn)行可持續(xù)生長；一些血管瘤生長部位特殊，可引起毀容和破潰等，具有一定的危險(xiǎn)性并影響局部器官功能。目前血管瘤的臨床治療具有多種治療方法，但對(duì)于血管瘤的生長分子機(jī)制尚不清楚。研究表明，在血管瘤快速增生期，可能由于HemECs內(nèi)部分基因的突變，從而激活相應(yīng)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)HemECs大量快速生長和增殖，而血管瘤消退的主要原因是HemECs的凋亡增加和分化、轉(zhuǎn)移[3-5]。成纖維細(xì)胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1)在血管生長過程中發(fā)揮重要作用[6]。 因此，本文通過RNA干擾技術(shù)敲減體外培養(yǎng)的HemECs細(xì)胞中FGFR1基因的表達(dá)，分析其表達(dá)量對(duì)HemECs細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)的影響，為理解嬰幼兒血管瘤的病程形成機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

EGM-2MV培養(yǎng)基購自Lonza；小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、Lipofectamine 2000和TRIzol購自Sigma；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR(qPCR)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和RIPA細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物研究所；Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁公司；Transwell小室購自Corning；Matrigel購自BD；抗磷脂酰肌醇3-激酶(phospoinositide 3-kinase，PI3K)單克隆抗體、抗蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)單克隆抗體、抗磷酸化AKT(p-AKT)單克隆抗體和抗GAPDH單克隆抗體購自Cellular Signaling Technology；辣根過氧化物酶標(biāo)記的II 抗購自武漢博士德有限公司。流式細(xì)胞儀購自BD；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自ABI；酶標(biāo)儀購自Thermo。

2 方法

2.1嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 共收集經(jīng)病理鑒定的嬰幼兒血管瘤6例，均獲得家屬知情或同意。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]的技術(shù)方法分選并鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)于EGM-2MV培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞傳至2～3代時(shí)，接種至6孔板中。

2.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長期嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為3組：對(duì)照(control)組、陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA, siRNA-NC)組和FGFR1 siRNA (si-FGFR1)組。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將siRNA-NC和si-FGFR1分別轉(zhuǎn)染入HemECs，常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照。

2.3qPCR檢測FGFR1 mRNA的表達(dá)量 收集各組轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，采用TRIzol提取細(xì)胞中總RNA。根據(jù)試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測。FGFR1 擴(kuò)增引物由Invitrogen合成，F(xiàn)GFR1上游引物序列為5’-CGCGGATCCATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTCT-3’，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGTCAGCGGCGTTTGAGTCCGCCATT-3’；β-actin引物上游序列為5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游序列為5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為： 95 ℃ 3 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、68 ℃ 2 min， 35 個(gè)循環(huán)； 68 ℃ 10 min。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2.4CCK-8法檢測細(xì)胞的活力 收集各組細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測570 nm的吸光度(A)值。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率 調(diào)整各組細(xì)胞濃度為1×109/L，每孔加入10 μL 膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，室溫孵育15 min，離心，棄上清，加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，4 ℃孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率。

2.6Transwell法檢測細(xì)胞侵襲和遷移 將-80 ℃冰箱中的Matrigel置于4 ℃冰箱中融化，與300 μL無血清培養(yǎng)基混合均勻，吸取100 μL加入Transwell上室，37 ℃孵育5 h。收集各組細(xì)胞，制成濃度為5×108/L的細(xì)胞懸浮液， 吸取100 μL細(xì)胞懸液接種至鋪有Matrigel的上室上孔，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h后；姬姆薩染色，200目鏡顯微鏡下拍照，取5個(gè)視野的平均值為細(xì)胞的侵襲數(shù)。在細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞懸浮液接種至未鋪有Matrigel的上室上孔中，其余與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

2.7Western blot法檢測PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平 收集各組細(xì)胞，調(diào)整為5×1010/L，加入100 μL現(xiàn)配PIPA裂解液，冰浴30 min，離心。收集上清，BCA法測定蛋白樣品濃度。吸取40 mg總蛋白與等體積2×上樣緩沖液混勻，沸水中變性10 min；在8% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，5%的脫脂奶粉封閉1 h；根據(jù)抗體說明書將抗PI3K、AKT和p-AKT抗體均以 1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入 II 抗，37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，避光，顯色，凝膠成像儀中拍照，Quantity One分析灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中FGFR1的mRNA表達(dá)量

與對(duì)照組相比，siRNA-NC組細(xì)胞中FGFR1的mRNA水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，si-FGFR1組細(xì)胞中FGFR1的mRNA水平顯著降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of FGFR1 in the HemECs after transfection with siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中FGFR1表達(dá)量的變化

2 敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)HemECs活力的影響

與對(duì)照組相比，siRNA-NC組HemECs細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，si-FGFR1組HemECs的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the viability of HemECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)HemECs細(xì)胞活力的影響

3 敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)HemECs凋亡的影響

與對(duì)照組相比，siRNA-NC組HemECs的凋亡率無顯著差異，si-FGFR1組HemECs的凋亡率顯著增加(P<0.05)，見圖3。

4 敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)HemECs遷移能力的影響

與對(duì)照組相比，siRNA-NC組遷移的HemECs數(shù)量無顯著差異，si-FGFR1組遷移的HemECs數(shù)量顯著降低(P<0.05)，見圖4。

5 敲除FGFR1基因表達(dá)對(duì)HemECs細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組相比，siRNA-NC組侵襲HemECs數(shù)量無顯著差異，si-FGFR1組侵襲HemECs數(shù)量顯著降低(P<0.05),見圖5。

6 敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比，siRNA-NC組HemECs中PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，si-FGFR1組HemECs細(xì)胞中的AKT蛋白無顯著變化，PI3K和p-AKT的蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

Figure 3.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the apoptosis of HemECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)HemECs凋亡的影響

Figure 4.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the migration ability of HemECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)HemECs遷移能力的影響

Figure 5.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the invasion of HemECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)HemECs侵襲能力的影響

討 論

血管瘤是一種常見的嬰幼兒良性腫瘤，主要病理特征為局部雜亂無章的血管過度生成，異常的內(nèi)皮細(xì)胞是其病變的主要原因。HemECs的增殖與凋亡間動(dòng)態(tài)平衡的破壞是血管瘤增生期向消退期轉(zhuǎn)變的主要原因，而增殖與凋亡平衡的失去主要受血管內(nèi)皮生長因子和抑制因子的調(diào)節(jié)。在多種血管生成抑制劑和促進(jìn)劑中，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是其中效率最高、特異性最強(qiáng)的促進(jìn)血管生成因子之一，通過與受體FGFR1結(jié)合促進(jìn)血管的形成，對(duì)血管的生成、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲過程至關(guān)重要[8-9]。FGFR1是成纖維細(xì)胞生長因子受體家族的成員之一，在血管瘤組織中的表達(dá)量上調(diào)[10]。研究表明，F(xiàn)GFR1在血管瘤增生期和退化期的表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著異常，提示FGFR1參與血管瘤的形成過程，與血管瘤的增生和退化顯著相關(guān)[11]。

Figure 6.The effect ofFGFR1 expression knock-down on the protein levels of PI3K, AKT and p-AKT. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6敲減FGFR1基因表達(dá)對(duì)PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平的影響

血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移在血管瘤的增生和消退期發(fā)揮重要作用。研究表明，在血管瘤消退期，細(xì)胞的凋亡率顯著增加，其中1/3為內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過轉(zhuǎn)染靶向FGFR1的siRNA下調(diào)HemECs中FGFR1基因的表達(dá)，CCK-8法檢測細(xì)胞的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減FGFR1的表達(dá)顯著抑制HemECs的細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)敲減FGFR1表達(dá)可顯著促進(jìn)HemECs凋亡；Transwell法檢測HemECs的遷移和侵襲能力顯示，F(xiàn)GFR1表達(dá)量下顯著降低HemECs的遷移能力，侵襲實(shí)驗(yàn)也表明si-FGFR1顯著抑制HemECs的侵襲能力，表明FGFR1可通過調(diào)控血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性，從而影響血管瘤的增生和消退。

PI3K/AKT信號(hào)通路在多種腫瘤組織中發(fā)揮作用，如胃癌[13]、乳腺癌[14]和肺癌[15]等。PI3K是一個(gè)由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在人類腫瘤中常被異常激活，激活的PI3K可活化AKT依賴性的一系列信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡和遷移[16-19]。與其它腫瘤相同，血管瘤內(nèi)也存在PI3K/AKT信號(hào)通路的異常激活。研究表明，異常激活的PI3K/AKT信號(hào)通路能顯著抑制無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的HemECs發(fā)生自發(fā)性凋亡[20]。在體外裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)中顯示，PI3K/AKT信號(hào)通路可能調(diào)控裸鼠移植血管瘤的增生與消退；抑制或激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)血管瘤體的消退及增生[21]。本研究通過Western blot檢測敲減FGFR1表達(dá)對(duì)HemECs中PI3K、AKT和p-AKT蛋白水平的影響，結(jié)果顯示siRNA-FGFR1對(duì)AKT蛋白水平無顯著影響，但可顯著下調(diào)PI3K和p-AKT蛋白的水平，提示下調(diào)FGFR1可能通過影響PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)HemECs的生物學(xué)特性。

綜上所述，敲減FGFR1的表達(dá)可抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)其凋亡，阻礙細(xì)胞遷移和侵襲。這些作用可能與下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，但該信號(hào)通路以及下游靶基因參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制還需進(jìn)一步明確。