田 甜，鄭 璐，湯 雷，余 蕾，謝汝佳，張金娟，韓 冰，楊 婷，丁凱澤，渠 巍，詹 瑋△，楊 勤△

(1貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550004； 貴陽市婦幼保健院 2檢驗科， 3輔助生殖中心， 貴州 貴陽 550003)

肝纖維化是許多慢性肝臟疾病，包括感染、自身免疫反應、 藥物治療和輻射等共同的病理過程，是損傷修復過程異常調節(jié)的結果。在這個過程中，肝臟中以I型膠原(collagen type Ⅰ,ColⅠ)為主的多種細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成增多、降解減少以致ECM大量聚集，導致肝組織結構變化而出現(xiàn)肝纖維化甚至肝硬化[1-3]。有研究表明在許多肝臟疾病肝組織中組蛋白修飾水平異常，并且這種異常和肝臟疾病發(fā)生發(fā)展有關。組蛋白H3第9位賴氨酸乙?；?histone H3 lysine 9 acetylation，acH3K9)和組蛋白H4第12位賴氨酸乙?；?histone 4 lysine 12 acetylation，acH4K12)可中和其氨基端賴氨酸殘基的正電荷，削弱組蛋白與DNA的接觸，從而促進基因轉錄;組蛋白H3第9位賴氨酸二甲基化(histone H3 lysine 9 dimethylation，H3K9me2)后可募集異染色質蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)從而引發(fā)基因表達沉默;而組蛋白H3第4位賴氨酸二甲基化(histone H3 lysine 4 dimethylation，H3K4me2)對基因表達的影響卻是相反的，它可以促進基因表達。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在大鼠原代肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化過程中acH3K9、acH4K12、H3K4me2和H3K9me2修飾水平異常[4-5]，然而在肝纖維化大鼠肝臟中上述組蛋白修飾水平是否異常，目前尚未見研究報道。因此本實驗采用CCl4復制肝纖維化大鼠模型，觀察肝纖維化大鼠肝臟中acH3K9、acH4K12、H3K4me2和H3K9me2修飾的變化，以探討組蛋白修飾與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關系。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠，體重200～220 g，由貴州省實驗動物中心提供[(黔)2003-001]。

2 主要試劑

丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；透明質酸(haluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、IV型膠原(collagen type Ⅳ，Col Ⅳ)和Ⅲ型前膠原(procollagen type III，PCⅢ)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；強細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、兔抗H3K9me2和兔抗H3K4me2抗體購自上海碧云天生物技術有限公司；鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和I型膠原單抗購自Santa Cruz；兔抗H3、兔抗acH4K12、兔抗acH3K9和兔抗β-actin抗體購自Bioworld Technology。

3 主要方法

3.1實驗分組 將20只大鼠隨機分成2組：正常(normal)組10只和CCl4肝纖維化模型(fibrotic)組10只。

3.2動物模型的制備 皮下注射40% CCl4花生油溶液3 mL/kg(首次用純CCl45 mL/kg)，間隔3 d注射1次以制備大鼠肝纖維化模型，共8周;正常組大鼠皮下注射等量植物油溶液。造模結束后股動脈放血處死(處死前稱體重)，留取血液及全部肝臟。稱肝臟濕重，每只大鼠取相同部位肝臟用10 %中性甲醛固定，剩余-80 ℃低溫冰箱保存；血液經(jīng)1 500 r/min離心10 min后將血清置于-80 ℃低溫冰箱保存。

3.3肝臟指數(shù)的測定 肝臟指數(shù)(%)=肝臟重量/體重×100%。

3.4肝組織病理形態(tài)的觀察 HE染色：將肝組織切片經(jīng)二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、 100%乙醇Ⅱ、 100%乙醇Ⅰ、 95%乙醇、 90%乙醇、 80%乙醇、 70%乙醇、50%乙醇、蒸餾水、蘇木素染液、鹽酸乙醇溶液、清水、清水、氨水溶液、伊紅染液、蒸餾水、 50%乙醇、70%乙醇、 80%乙醇、 90%乙醇、 95%乙醇、 100%乙醇Ⅰ、 100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通風櫥封片。 Masson 染色切片將肝組織脫蠟、蘇木素染、流水稍洗、 1%鹽酸乙醇分化、流水沖洗、麗春紅酸性品紅液染、蒸餾水、 1%磷鉬酸水溶液、2.5%亮綠液染色、 1%冰醋酸、 95%乙醇、 100%二甲苯。鏡下觀察肝臟組織病理形態(tài)及肝損傷程度。

3.5肝功能的檢測 采用全自動生化分析儀，對血清 ALT和AST進行檢測。

3.6肝纖維化指標檢測 放射免疫分析法檢測血清 HA、 LN、 PCIII和Col Ⅳ的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3.7Western blot法檢測肝臟組織中α-SMA和Ⅰ型膠原的含量及acH3K9、 acH4K12、H3K4me2和H3K9me2的修飾水平 提取蛋白，SDS-PAGE，轉膜，脫脂奶粉封閉，加入對應抗體，4 ℃ 過夜。次日用TBST 洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的 II 抗，室溫孵育90 min，ECL發(fā)光成像，條帶用Image Lab圖像分析軟件對每個條帶吸光度(A)值進行定量分析。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組樣本均數(shù)比較采用兩個獨立樣本的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 動物的一般情況

造模后3～4周間，模型組有1只大鼠死亡，尸檢結果可見腹部有大量油狀液體堆積，可能是急性感染所致。

2 正常組和模型組大鼠肝臟指數(shù)和大鼠血清肝功能的比較

對大鼠肝臟的形態(tài)學觀察可見，正常對照組肝臟色澤紅潤，表面光滑，質地均勻、柔軟，彈性好；模型組大鼠肝臟呈紅褐色，表面有顆粒狀結節(jié)，質地較硬。CCl4致肝纖維化模型大鼠肝指數(shù)及ALT和AST明顯高于正常對照組(P<0.05),見表1。

表12組大鼠肝臟指數(shù)和血清肝功能的比較

Table 1.The levels of liver index and liver function in the rats between the 2 groups (Mean±SD)

GroupnLiver index (mg/g)AST (U/L)ALT (U/L)Normal10 3.81±0.17 20.8±5.550.3±8.6Fibrotic9 5.98±0.69?90.4±3.6?150.5±9.5?

*P<0.05vsnormal group.

3 正常組和模型組大鼠肝臟病理學的觀察

正常組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，竇周隙無膠原纖維增生；模型組大鼠肝索排列紊亂，有纖維結締組織大量增生，有增生的纖維結締組織分割原來的肝小葉并包繞形成大小不等的圓形或橢圓形的假小葉，見圖1、2。

Figure 1.HE staining of rat hepatic tissues of each group (×200).

圖1正常組和模型組大鼠肝組織HE染色結果

Figure 2.Masson staining of rat hepatic tissues of each group (×200).

圖2正常組和模型組大鼠肝組織Masson染色結果

用METAVIR五級(F0：肝門無纖維化；F1：肝門纖維化、無分隔；F2：肝門纖維化、少許分隔；F3：大量分隔、無肝硬化；F4：肝硬化)評分系統(tǒng)進行膠原纖維增生程度半定量分級。結果表明模型組大鼠肝臟纖維化分級以F2～3級為主，明顯高于正常對照組(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠肝纖維化程度分級

*P<0.05vsnormal group.

4 正常組和模型組大鼠血清肝纖維化指標的檢測

與正常組比較，模型組 HA、 LN、ColⅣ和PCⅢ的水平顯著升高(P<0.05)，見表3。

5 Western blot法分析2組大鼠肝臟組織α-SMA和I型膠原蛋白的表達水平，以及acH3K9、acH4K12、H3K4me2和H3K9me2的修飾水平

表3 2組大鼠血清肝纖維化指標檢測

*P<0.05vsnormal group.

正常組大鼠肝組織有一定量α-SMA表達，幾乎不表達I型膠原，而肝纖維化組大鼠肝組織中α-SMA和I型膠原表達明顯較正常大鼠高(P<0.05)。和正常組大鼠相比，肝纖維化組大鼠肝組織中acH3K9和H3K9me2的修飾水平明顯增加(P<0.05)，acH4K12的修飾水平較正常組大鼠明顯減少(P<0.05)，而H3K4me2的修飾水平與正常組比較差異無統(tǒng)計學顯著性,見圖3。

Figure 3.The protein levels of α-SMA, Col Ⅰ, acH4K12, acH3K9, H3K9me2 and H3K4me2 in the rat liver. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsnormal group.

圖3正常組和肝纖維化組大鼠肝臟組織中α-SMA和I型膠原蛋白表達水平，以及acH4K12、acH3K9、H3K9me2和H3K4me2的修飾水平

討 論

由各種慢性肝病遷延不愈導致的肝纖維化在臨床上非常常見，CCl4誘導大鼠肝纖維化是一個非常經(jīng)典的肝纖維化模型，本實驗中我們采取每隔3 d、連續(xù)8周對大鼠皮下注射CCl4的方法來復制大鼠肝纖維化模型。我們發(fā)現(xiàn)皮下注射CCl48周后大鼠的肝指數(shù)、血清ALT、AST、肝纖維化4項指標均顯著增加；病理組織學HE染色、Masson膠原染色也顯示皮下注射CCl48周后大鼠肝臟有較多炎性細胞浸潤并伴有間質膠原纖維增加，有部分區(qū)域增生的纖維結締組織分割包繞肝小葉形成假小葉，肝纖維化分級主要以2～3級為主，明顯高于正常對照組大鼠，檢測大鼠肝臟中α-SMA和I型膠原蛋白的表達量也明顯高于正常組，表明我們復制的大鼠肝纖維化模型建立成功。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白共價修飾可能參與了多種慢性肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展過程。Jun等[6]在高脂飲食大鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)含Jumonji-C結構域的組蛋白去甲基化酶(Jumonji-C domain containing histone demethylase，JHDM/JMJD)較正常組大鼠肝組織低，由此他們推測H3K4me3和H3K9me3的修飾水平異?？赡艽龠M非酒精性脂肪肝的發(fā)展。Zhao等[7]發(fā)現(xiàn)在肝癌病理組織中賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine-specific demethylase 1，LSD1)的表達明顯增高，且隨著肝細胞癌患者腫瘤病理分期等級增加，LSD1表達水平也逐步增高，病人的5年生存率更低，預示LSD1表達水平與肝癌腫瘤病人的惡性程度及預后相關。

本研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化大鼠肝臟中H3K9me2、acH3K9和acH4K12的修飾水平異常，具體表現(xiàn)為H3K9me2和acH3K9的修飾水平明顯較正常對照組大鼠增加，而acH4K12的修飾水平卻明顯較正常對照組大鼠減少，H3K4me2的修飾水平?jīng)]有明顯變化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的大鼠原代激活型HSCs中acH3K9和H3K9me2的修飾水平較靜止型HSCs中明顯降低[4]，這一結果與體內觀察到的組蛋白修飾結果剛好相反，我們推測大鼠肝臟組織中主要以肝細胞為主(占肝細胞總數(shù)的55%)，而HSCs僅占15%，因此在肝纖維化大鼠肝臟中觀察到acH3K9和H3K9me2的修飾增加有可能代表的是肝細胞組蛋白修飾的變化。有研究觀察到乙醇刺激大鼠原代肝細胞后細胞中acH3K9的修飾水平增高[8]；有類似研究發(fā)現(xiàn)，與肝細胞相比，大鼠原代激活型HSCs需乙醇刺激更長時間，細胞中acH3K9的修飾水平才會增加[9]。這些研究結果支持我們上述推測。有研究發(fā)現(xiàn)，在膽汁淤積所致的大鼠肝纖維化肝臟中TGF-β基因啟動子區(qū)的H3K9me2水平降低，從而促進TGF-β基因轉錄，使TGF-β蛋白表達升高，導致肝纖維化發(fā)生發(fā)展[10]。由此我們推測大鼠肝纖維化肝臟中H3K9me2的修飾水平降低有可能通過調控促肝纖維化相關蛋白如α-SMA和Ⅰ型膠原等的表達，從而參與肝纖維化的發(fā)生。

有研究表明在肝硬化患者肝組織中H3K4me2的去甲基化轉移酶RBP2和α-SMA表達上調，沉默人HSCs細胞株LX-2中RBP2基因后發(fā)現(xiàn)細胞中α-SMA表達下調，而過表達LX-2細胞中RBP2基因后發(fā)現(xiàn)細胞中α-SMA的表達上調，因此認為RBP2調控了肝硬化患者肝臟中α-SMA的表達，從而參與肝硬化的病理過程[11]。我們在肝纖維化大鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)H3K4me2修飾水平與正常組無明顯變化，有可能是本實驗中的肝纖維化大鼠病理分級較輕，如果延長肝纖維化造模時間，大鼠肝臟纖維化程度加重，肝組織中H3K4me2修飾水平可能會發(fā)生明顯變化。

綜上所述，大鼠肝纖維化肝臟中acH4K12、acH3K9和H3K9me2的修飾水平異常。這些異常變化可能與細胞外基質代謝相關基因轉錄調控有關，從而參與了大鼠肝纖維化發(fā)生。