南川川，李 楠，李 威，洪澄英，陳懷生，劉雪燕△

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院, 南方科技大學附屬第一醫(yī)院， 深圳市人民醫(yī)院 1重癥醫(yī)學科， 2口腔醫(yī)學中心， 廣東 深圳 581000)

膿毒癥(spesis)是指由感染引起的臟器功能障礙，進一步發(fā)展可導致膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征。腎臟功能障礙是膿毒癥常見而且嚴重的并發(fā)癥，急性腎功能衰竭(acute renal failure)發(fā)生率在一般膿毒癥患者約為19%，在重度膿毒癥約為23%，在血培養(yǎng)陽性的膿毒性休克患者中約為51%[1]，而急性腎衰會加重病情導致患者死亡[2]。膿毒癥導致腎衰的發(fā)病過程中，凝血功能障礙及炎癥反應起到了重要作用[3]。

血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)是廣泛表達于血管內(nèi)皮細胞表面的跨膜蛋白受體，作為蛋白C系統(tǒng)的重要組成部分，它是蛋白C活化過程中重要的調(diào)節(jié)因子，不僅具有改善凝血的功能，還具有抑制炎癥激活作用[4]。

血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)是體內(nèi)血紅素代謝的重要起始酶和限速酶，能夠催化血紅素分解為一氧化碳、膽綠素和鐵離子，其代謝產(chǎn)物具有抑制炎癥因子，抗氧化活性，同時具有調(diào)節(jié)血管張力、抗凋亡和細胞保護及改善凝血功能的作用[5-6]。Sambuceti等[7]和Maruyama等[8]在大鼠糖尿病模型中及內(nèi)毒素體外細胞實驗中觀察到HO-1對于內(nèi)皮細胞表面TM具有保護作用并促進其表達，而且在膿毒性休克時HO-1對腎臟具有保護作用[9]。但是，膿毒癥時HO-1的腎臟保護作用能否通過TM介導目前還沒有研究。

本實驗旨在探討HO-1對于膿毒癥大鼠腎臟的保護作用機制，觀察膿毒癥大鼠腎臟TM表達的變化以及HO-1對其影響。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

HO-1誘導劑氯化血紅素(hemin)與抑制劑鋅原卟啉(zinc protoporphyrin, ZnPP)IX購自Sigma；兔抗大鼠TM多克隆抗體購自Santa Cruz；TM的ELISA檢測試劑盒購自中國易利生物公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的ELISA檢測試劑盒購自中國藍基生物公司；活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin, APTT)和凝血酶原時間(prothrombin time, PT)檢測試劑盒購自北京中勤世帝公司。

2 實驗分組及動物模型

膿毒癥模型的制作參照傳統(tǒng)的盲腸結(jié)扎-穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)法。72只雄性Wistar大鼠，6～8周，體重220 g±30 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物合格證編號為211002300018206，隨機分為4組:假手術(sham)組、膿毒癥(CLP)組、HO誘導劑(CLP+hemin)組和HO抑制劑(CLP+ZnPP)組，每組18只。CLP、CLP+hemin和CLP+ZnPP 3組大鼠于術前12 h分別腹腔內(nèi)注射PBS、hemin(50 μmol/kg)和ZnPP(50 μmol/kg)。動物術前禁食12 h，自由飲水，戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，無菌條件下作腹白線正中切口約1.5 cm，分離盲腸，用3-0絲線在距離盲腸根部1/3處環(huán)形結(jié)扎，保持腸道通路正常，用16碼針頭分別在盲腸的近端和末端各穿一個孔，擠出少許糞便于腹腔內(nèi)，回納盲腸，分層縫合腹腔。術后即刻給動物皮下注射生理鹽水30 mL/kg，補充術中液體丟失；假手術組僅做開腹、分離盲腸遠端與大腸系膜及關腹手術。術后動物均自由進食及飲水。在術后6、12和24 h每組小鼠分別隨機選取6只，暴露腹主動脈，收集動脈血，將血液與3.8%枸櫞酸鈉以9∶1的比例充分混合，1 660×g離心10 min，留取上層血漿至-80 ℃保存；取腎臟組織，小部分于液氮凍存，其余常規(guī)沖洗后多聚甲醛固定。

3 主要方法

3.1碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin,CoHb)濃度測定 留取25 μL血漿，加入連二亞酸鈉溶液還原后通過雙波長吸光度比值法檢測血漿中碳氧血紅蛋白濃度：在同等實驗條件下分別應用分光光度計測得0%COHb、100%COHb及待檢樣品在420 nm和432 nm波長處的吸光度(A)值，應用波爾定律計算出血漿中血紅蛋白及COHb的比例,從而得出COHb的濃度，以反映大鼠體內(nèi)HO-1的活性。

3.2血漿中TM、TNF-α和IL-1β的檢測 血漿中以上各種指標的檢測應用酶聯(lián)免疫吸附法按照試劑盒說明書要求檢測。

3.3PT、APTT、肌酐(creatinine,Cr)及胱抑素C(cystatin-C, Cys-C)的檢測 按照PT和APTT試劑盒說明書要求應用M600L全自動凝血因子分析儀檢測PT和APTT。Cr和Cys-C應用FR-40全自動生化分析儀檢測。

3.4腎臟組織血栓形成情況觀察 腎組織用10%緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，切片(5 μm)用馬休黃/猩紅/天青石藍(Martius scarlet blue,MSB)染色法[10]確認血栓形成，紅色代表微血栓，并用半定量的光鏡檢查。隨機選取50例腎小球沿赤道切取并觀察。在每個腎小球中，評估腎小球毛細血管與微血栓填充到腎小球總毛細血管面積的比率，并將腎小球分為5類：5%、6%至25%、26%至50%、51%至75%和76%至100%。每組對應的腎小球數(shù)目代表各組微血栓形成的情況。

3.5應用Western blot檢測TM在腎臟的表達 液氮凍存大鼠腎臟組織裂解，提取蛋白并純化，用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，各組取50 μg蛋白行12%SDS-PAGE (80 V，3 h)后,轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜，應用2%的脫脂奶粉(PBS稀釋, pH 7.14)4 ℃封閉硝酸纖維素膜過夜,加入TM Ⅰ抗, 37 ℃孵育2 h。洗膜后,應用辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗孵育后顯影曝光，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 HO-1的活性

與sham組相比，其余3組大鼠血漿COHb濃度均顯著升高(P<0.05)，且CLP+hemin組COHb濃度顯著高于CLP組(P<0.05)，CLP+ZnPP組則顯著低于CLP組和CLP+hemin組(P<0.05)，表明hemin能夠增強大鼠體內(nèi)HO-1的活性,見表1。

2 腎功能指標

與sham組相比，術后各時點其余3組大鼠腎功能均減低(P<0.05)，血漿中Cr和Cys-C水平顯著增高(P<0.05)；與CLP組相比，CLP+hemin組Cr和Cys-C水平下降顯著(P<0.05)，CLP+ZnPP組較CLP+hemin組顯著升高(P<0.05)，見表1。

3 凝血功能指標

大鼠CLP后PT和APTT較sham組顯著縮短(P<0.05)，hemin的干預使大鼠PT和APTT較CLP組顯著延長(P<0.05)，CLP+ZnPP組PT和APTT較CLP+hemin組顯著縮短(P<0.05)，見表1。

4 炎癥因子水平

3組大鼠血漿炎癥因子明顯較sham組顯著增高(P<0.05)，CLP+hemin組TNF-α和IL-1β水平較CLP組顯著降低(P<0.05)，CLP+ZnPP組較CLP+hemin組顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1血漿中各項指標檢測

Table 1.Blood samples were taken from the rats in each group, and the levels of COHb, Cr, Cys-C, TNF-α, IL-1β, soluble TM (sTM), PT and APTT were measured (Mean±SD.n=6)

GroupCOHb (%)Cr (mg/dL)Cys-C(μg/dL)PT (s)APTT (s)TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)sTM(μg/L)Sham 6 h0.96±0.05 0.25±0.04136.0±12.811.35±0.6823.54±0.77143.1±11.643.9±4.885.2±5.2 12 h0.97±0.050.27±0.06129.0±13.211.41±0.8223.46±0.97158.5±13.548.6±4.986.6±6.1 24 h0.97±0.040.24±0.05131.0±13.311.39±0.8823.69±1.23163.5±15.152.1±5.184.8±5.4CLP 6 h2.58±0.05?0.45±0.04?381.0±29.4?9.71±0.60?20.12±0.98?2 532±113?346±35?163.5±11.4? 12 h2.86±0.03?0.54±0.06?452.0±37.3?9.03±0.77?19.87±1.26?3 213±131?417±38?183.1±13.9? 24 h2.64±0.05?0.57±0.05?571.0±49.5?8.52±0.93?18.04±1.63?2 857±126?363±34?175.6±12.3?CLP+hemin 6 h3.55±0.04?△0.36±0.03?△284.0±22.6?△10.64±0.63?△22.05±1.12?△1 782±76?△212±27?△117.5±10.2?△ 12 h3.86±0.05?△0.41±0.05?△367.0±35.8?△10.06±0.72?△20.84±1.24?△2 190±91?△261±26?△131.4±12.1?△ 24 h3.60±0.05?△0.44±0.06?△418.0±38.6?△9.75±0.91?△20.05±1.75?△1 925±90?△237±29?△128.7±11.6?△CLP+ZnPP 6 h1.78±0.02?△#0.49±0.06?#392.0±35.9?#9.32±0.68?#20.03±1.13?#2 661±119?#352±40?#171.3±12.8?# 12 h1.82±0.04?△#0.59±0.07?#489.0±39.8?#9.01±0.97?#19.46±1.48?#3 370±128?#431±39?#186.9±15.1?# 24 h2.01±0.06?△#0.61±0.07?#589.0±50.1?#8.31±0.96?#18.03±1.75?#2 995±129?#374±37?#180.7±15.7?#

*P<0.05vssham group;△P<0.05vsCLP group;#P<0.05vsCLP+hemin group.

5 腎臟血栓形成情況

對腎臟MSB染色切片中血栓形成的分析表明，在CLP組中，所有腎小球充滿微血栓，占腎小球毛細血管的大部分；與CLP相比，hemin預給藥可顯著降低腎小球微血栓形成;ZnPP的預處理對腎小球微血栓形成無影響，見圖1。

Figure 1.HO-1 attenuates microthrombus formation in the glomeruli during sepsis. The scale bar=25 μm.

圖1HO-1減輕膿毒癥大鼠腎小球微血栓形成

6 TM的表達

與sham組相比，CLP組大鼠腎臟TM表達顯著下降(P<0.05)，血漿游離TM顯著增加(P<0.05)，而hemin干預可以使CLP大鼠腎臟TM表達顯著增加(P<0.05)，血漿游離TM顯著下降(P<0.05)，ZnPP則起到相反作用,見圖2、表1。

Figure 2.Western blot showed that HO-1 up-regulated the protein expression of TM in the kidney during sepsis. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;△P<0.05vsCLP group;#P<0.05vsCLP+hemin group.

圖2HO-1增加膿毒癥大鼠腎臟組織TM的表達

討 論

在本實驗中，我們通過盲腸結(jié)扎穿孔制備膿毒癥大鼠模型，分別給予HO-1誘導劑hemin和HO-1抑制劑ZnPP，觀察HO-1在膿毒癥大鼠腎臟功能損傷中的作用，結(jié)果顯示膿毒癥大鼠血漿中炎癥因子及游離TM增加，凝血功能障礙，腎臟TM表達下降，腎小球微血管內(nèi)血栓形成明顯，腎臟功能障礙；Hemin干預使腎臟TM表達增加，血漿游離TM下降，炎癥減輕，凝血功能改善，腎小球微血栓形成減少，腎臟功能明顯改善，表明在膿毒癥大鼠模型中，HO-1能通過TM發(fā)揮抗炎和抗凝血作用，從而起到腎臟保護作用。

近年研究認為，凝血功能障礙和炎癥反應是膿毒癥引發(fā)各種器官功能障礙的重要病理過程[11]，兩者相互協(xié)同，共同加重了膿毒癥的病理損傷。在組織嚴重受損時，毒素及炎癥激活凝血和纖溶系統(tǒng)，全身呈高凝血狀態(tài)，引起彌散性血管內(nèi)凝血，腎小球內(nèi)微血栓形成，從而形成機械性梗阻，降低腎小球濾過率[3，12]。

在多種病理狀態(tài)下，HO-1可被血紅素和內(nèi)毒素等多種因素誘導表達增加[13]，能夠改善腎臟血流動力學抑制腎臟炎癥反應[14]，改善腎功能[15]。在我們的研究中，CLP誘導的膿毒癥大鼠血漿中Cys-C和Cr水平顯著升高，說明腎臟功能損傷明確存在，HO-1的誘導能夠顯著降低Cys-C和Cr水平，改善腎臟功能。HO-1通過調(diào)控cGMP抑制血小板聚集[16]，而且外源性給予HO-1的代謝產(chǎn)物一氧化碳可以下調(diào)膿毒癥小鼠及人臍靜脈內(nèi)皮細胞NF-κB的表達，并抑制組織因子及PAI-1，從而抑制微循環(huán)血栓形成[17]。盡管研究表明在膿毒癥大鼠模型中HO-1表達增強具有腎臟保護作用，但是之前的研究并沒有評估腎臟血栓形成情況[9]。

TM是表達于內(nèi)皮細胞表面的跨膜蛋白受體蛋白，它可與凝血酶結(jié)合降低凝血酶的活性，凝血酶結(jié)合TM后能使凝血酶的滅活速度比在自然下快了20倍, 直接導致循環(huán)中的凝血酶清除[18]。同時它們的復合物特異性激活蛋白C使其轉(zhuǎn)化為具有抗凝及抗炎活性的活化蛋白C；TM所含有的特定結(jié)構(gòu)域可以維持細胞功能和細胞間連接的完整性, 直接抑制炎性細胞黏附, 阻止炎性細胞遷移，還可與NF-κB等促炎因子結(jié)合抑制其活性從而起到抗炎作用[19]，因此TM是蛋白C系統(tǒng)行使抗凝及抗炎作用的重要因素[20-21]。膿毒癥時腎臟受到炎癥因子介導的損傷，主要是TNF-α和IL-1β，二者均可以引發(fā)其它炎癥因子的釋放，同時也可以導致血管的收縮，中性粒細胞的集聚，活性氧的生成，組織因子的釋放和促進血栓的形成[22]，而且TNF-α和IL-1β造成血管內(nèi)皮細胞損傷，抑制TM轉(zhuǎn)錄造成內(nèi)皮細胞TM表達下降[23]，血漿游離TM增加，TM在血漿中的增加是由于TM從受損的血管內(nèi)皮細胞釋放到血流中引起的，提示炎癥介導的內(nèi)皮損傷確實發(fā)生[24]。

膿毒癥時給予HO-1激動劑可以通過MAPK等多個途徑抑制內(nèi)毒素刺激的炎癥因子IL-1β和TNF-α的釋放[25]。在本研究，膿毒癥大鼠血漿中TNF-α和IL-1β及游離TM增加，凝血功能障礙，腎臟TM表達下降，腎小球微血管內(nèi)血栓形成明顯；Hemin干預使腎臟TM表達增加，血漿TNF-α和IL-1β及游離TM下降，凝血功能得到改善，腎小球微血栓形成減少，表明在膿毒癥大鼠模型中，HO-1能通過TM發(fā)揮腎臟保護作用。

血紅素氧合酶在多種病理過程中表現(xiàn)出了明顯的作用，但具體機制至今尚未完全闡明，本實驗進一步從TM途徑研究了HO-1對于腎臟功能的保護作用，豐富了HO-1改善凝血功能障礙及抗炎的機制，為HO-1的臨床應用提供參考資料。