梁木林，黨紅星，魯 雪，方 芳，劉成軍，許 峰

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地， 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400014)

高體積分?jǐn)?shù)氧(高氧，hyperoxia)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)吸入可引發(fā)兒童肺損傷[1]，高氧誘導(dǎo)的肺損傷在組織學(xué)上可分為急性期和慢性纖維化期2個(gè)階段，2者的病理改變不同，即早期肺組織表現(xiàn)為炎癥滲出和水腫，晚期則表現(xiàn)為肺泡明顯增厚和成纖維細(xì)胞增生[2]。肺損傷纖維化發(fā)生的主要機(jī)制是炎癥損傷和損傷后異常修復(fù)[3]，但纖維化進(jìn)展的機(jī)制尚不完全清楚，仍然缺乏有效手段干預(yù)纖維化[4]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活與增殖，抑制mTOR對(duì)肺損傷及纖維化有潛在的治療作用[5]。本研究以3周齡SD幼鼠為研究對(duì)象，復(fù)制高氧肺損傷動(dòng)物模型，探討mTOR復(fù)合物1(mTOR complex 1, mTORC1)抑制劑雷帕霉素(rapamycin,Rapa)和mTORC1/2雙重抑制劑OSI-027抑制mTOR信號(hào)通路對(duì)高氧肺損傷時(shí)磷酸化AKT1(phosphorylated AKT1,p-AKT1)分子的影響及其在高氧肺損傷纖維化中的作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD幼鼠(體重44.8 g±2.75 g，雌雄不限，3周齡)，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)為SCXK(渝)2018-0003,敷料、飼料和水源由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院動(dòng)物房統(tǒng)一供應(yīng)。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審核批準(zhǔn)。

2 主要試劑

抗兔p-AKT1單克隆抗體(批號(hào)ab81283)、抗兔磷酸化核糖體蛋白S6激酶1(phosphorylated ribosomal protein S6 kinase 1, p-S6K1)多克隆抗體(批號(hào)ab131436)、抗鼠β-actin單克隆抗體(批號(hào)ab8226)、生物素化山羊抗鼠IgG(H+L)(批號(hào)ab6789)及生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(批號(hào)ab6721)均購(gòu)自Abcam；山羊抗兔工作液(批號(hào)SP-9001)、正常山羊血清(批號(hào)ZLI-9021)及濃縮型DAB試劑盒(批號(hào)K135925C)購(gòu)自北京中山金橋生物有限公司；雷帕霉素(批號(hào)R8140)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；OSI-027(批號(hào)HY-10423/CS-0257)購(gòu)自MedChemExpress；全蛋白提取試劑盒(批號(hào)KGP2100)和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)KGP903)購(gòu)自南京凱基生物公司；預(yù)染蛋白Marker(批號(hào)00215343)購(gòu)自NEB；ECL發(fā)光試劑盒(批號(hào)BL520A)購(gòu)自Thermo；PVDF膜購(gòu)自Hybond。

3 主要方法

3.1動(dòng)物分組 將72只SD幼鼠(雌雄不限，3周齡)應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行完全隨機(jī)化分為：空氣+生理鹽水組[空氣(air)組]、高氧+生理鹽水組[高氧(hyperoxia)組]、高氧+OSI-027(hyperoxia OSI)組和高氧+雷帕霉素(hyperoxia Rapa)組，分別建立動(dòng)物模型(各組n=18)。

3.2動(dòng)物模型制備 采用本課題組原創(chuàng)的高氧致幼年大鼠肺損傷動(dòng)物模型[6]。高氧暴露各組SD幼鼠,置于自制塑料飼養(yǎng)氧箱(60 cm×50 cm×40 cm)中，飼養(yǎng)箱進(jìn)氣孔持續(xù)輸入99.9%的高純度醫(yī)用氧氣，維持氧體積分?jǐn)?shù)為90%(CY-12C型數(shù)字測(cè)氧儀，浙江杭州建德市利達(dá)儀器廠)，用鈉石灰吸收二氧化碳，使其濃度<0.5%。環(huán)境溫度25 ℃～27 ℃，濕度60%～70%。每天定時(shí)上午10:00開(kāi)箱30 min，更換敷料并添加水和飼料?？諝饨M置于同一室內(nèi)空氣(FiO2=0.21)中，飼養(yǎng)條件與高氧暴露各組相同,其中，空氣組和高氧組經(jīng)腹腔注射0.5 mL生理鹽水，高氧+雷帕霉素組經(jīng)腹腔注射雷帕霉素(1.5 mg·kg-1·d-1)[7]，高氧+OSI-027組經(jīng)腹腔注射OSI-027(0.5 mg·kg-1·d-1)[8]，均用生理鹽水稀釋至總體積0.5 mL。按照每周3次的用法于第1、3、6、8、10和13天時(shí)一次性給藥，給藥1 h后予高氧(FiO2=0.90)或空氣(FiO2=0.21)暴露。高氧暴露第1天肺組織開(kāi)始發(fā)生急性肺損傷病理改變，因而藥物干預(yù)選擇高濃度氧暴露第1天作為研究高氧肺損傷的給藥起始時(shí)點(diǎn)。

3.3各組SD幼鼠的生存率、一般狀況及體重 觀察并記錄各組SD幼鼠的精神、生長(zhǎng)、存活、覓食、呼吸、活動(dòng)度、刺激后反應(yīng)；體毛光澤、生長(zhǎng)發(fā)育及體重變化等情況。

3.4標(biāo)本采集 各組SD幼鼠分別于建模第3、7和14天，取肺組織用于實(shí)驗(yàn)研究。各SD幼鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，碘伏消毒胸腹部皮膚，沿中線剪開(kāi)皮膚，剪開(kāi)胸腔(注意避開(kāi)胸壁內(nèi)的血管)，然后用大頭針將兩側(cè)胸壁固定在泡沫板上，充分暴露心肺及縱膈組織，用鑷子從上縱膈處提起心肺及血管組織，剪下肺葉,其中左肺浸入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行肺組織病理學(xué)檢查及免疫組化檢查；右中上肺稱重后放入-80 ℃冰箱保存，用于目標(biāo)蛋白的檢測(cè)；取出右下肺測(cè)肺組織濕/干重比(wet/dry weight ratio, W/D)。

3.5肺組織W/D的測(cè)定 取右下肺放置吸水濾紙上蘸干表面血滯，立即用電子秤(萬(wàn)分之一分析天平)稱重記作肺濕重；各稱重后的右下肺，用濾紙包好標(biāo)記，置于70 ℃烤箱內(nèi)48 h后分別稱重記作肺干重；計(jì)算肺W/D。

3.6肺組織病理學(xué)檢查 新鮮取材的左肺組織分別置于盛有4%多聚甲醛溶液固定24～72 h，而后用流水沖洗固定肺組織，脫水、透明、石蠟浸泡、包埋、切片、脫蠟、HE染色和封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變，采集圖像。

3.7肺損傷的評(píng)分 HE染色后的切片在顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。根據(jù)美國(guó)胸科學(xué)會(huì)2011年發(fā)布的肺組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]，按照“A：肺泡腔嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；B：肺間質(zhì)嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；C：透明膜；D：肺泡腔滲出蛋白質(zhì)碎屑；E：肺泡間隔增厚”進(jìn)行肺損傷評(píng)分，每張切片觀察20個(gè)視野。肺損傷評(píng)分=[20×(A)+14×(B)+7×(C)+7×(D)+2×(E)]/(觀察視野數(shù)×100)。采用雙盲法由2人對(duì)每張切片獨(dú)立評(píng)分，計(jì)算平均值，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。肺損傷評(píng)分越高表示病變程度與病變范圍越大。

3.8肺泡間隔厚度測(cè)定 用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cyberne-tics)測(cè)定在400倍下肺泡間隔厚度，每張切片觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)測(cè)3個(gè)不同肺泡壁，取平均值作為肺泡間隔厚度。

3.9免疫組化檢測(cè)p-AKT1和p-S6K1在肺組織中的分布 固定肺組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，室溫下行3%甲醇-H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min；將切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐加熱修復(fù)抗原；滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；然后滴加 I 抗(p-AKT1抗體：1∶50;p-S6K1抗體：1∶100)，4 ℃過(guò)夜，滴加生物素化 II 抗(山羊抗兔工作液)，37 ℃、30 min；DAB室溫顯色；蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片；鏡檢并采集圖像。然后進(jìn)行免疫組化結(jié)果判定：胞核和(或)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，每個(gè)視野取3個(gè)分割塊，每個(gè)分割塊用涂色方式每次分割3～4個(gè)細(xì)胞。40倍物鏡頭取圖，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)其陽(yáng)性信號(hào)平均吸光度以反映p-AKT1和p-S6K1蛋白表達(dá)相對(duì)含量, 平均吸光度越大，p-AKT1和p-S6K1蛋白含量越高。

3.10Western blot 法測(cè)定肺組織中p-AKT1和p-S6K1的蛋白水平 將-80 ℃凍存各組稱重的肺組織剪碎后放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中；用移液管向每管中加入0.5 mL的含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液[按0.5 mL裂解液加5 μL PMSF(50 mmol/L)的比例加入搖勻至無(wú)結(jié)晶的1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑5 μL]作為勻漿介質(zhì)；將盛有標(biāo)本的勻漿器下端插入冰水混合物中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)搗桿數(shù)10次，充分研磨，盡量避免產(chǎn)生泡沫，將組織塊研磨至肉眼看不見(jiàn)，冰上靜置30 min；用微量移液器將制備好的勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL進(jìn)口EP管中，置于低溫高速離心機(jī)中，4 ℃、12 000×g離心30 min；小心吸取上清(原始的總蛋白樣本)提取樣品全蛋白分裝于標(biāo)記好的新EP管中；置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。然后行Western blot法測(cè)定樣品蛋白表達(dá)：BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度，熱循環(huán)儀95 ℃蛋白變性，配膠、上樣、SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，TBST buffer稀釋的5% BSA液封閉，分別滴加I 抗[p-AKT1(1∶2 000)、p-S6K1(1∶200)和β-actin(1∶5 000)]4 ℃孵育過(guò)夜，II 抗(1∶5 000)室溫孵育2～3 h，ECL顯影、定影，用Bio-Rad ChemiDoc XRS+System凝膠掃描成像儀和Image Lab凝膠分析系統(tǒng)軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析處理。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布獨(dú)立性的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，計(jì)量資料的整體分析經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后采用無(wú)交互作用的雙因素方差分析。組內(nèi)和組間進(jìn)一步比較采用給定時(shí)間做各組兩兩比較，給定組別做不同時(shí)間兩兩比較，方差齊則采用Tukey HSD法檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高氧及mTOR抑制劑對(duì)SD幼鼠一般狀況、生存、生長(zhǎng)和體重增長(zhǎng)的影響

各組SD幼鼠均100%存活?？諝饨MSD幼鼠精神飽滿，自主活動(dòng)靈敏，飲食好，刺激后反應(yīng)敏捷，體毛整潔光滑，呼吸平穩(wěn)，生長(zhǎng)發(fā)育及體重增長(zhǎng)良好;與空氣組比較，高氧組各時(shí)點(diǎn)SD幼鼠精神欠佳，活動(dòng)減少，飲食差，刺激后反應(yīng)遲鈍，體毛凌亂，呼吸急促，生長(zhǎng)發(fā)育及體重增長(zhǎng)緩慢(P<0.05);與高氧組比較，高氧+雷帕霉素組和高氧+OSI-027組第3和7天SD幼鼠一般狀況大致相同，體重增長(zhǎng)亦緩慢，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與高氧+雷帕霉素組比較，高氧+OSI-027組第3和7天SD幼鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表1。

2 肺組織的病理學(xué)觀察

第3、7和14天時(shí)空氣組的肺結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯炎癥病變；與空氣組比較，高氧組的肺組織表現(xiàn)程度不同的損傷，肺泡隔增寬，肺泡腔內(nèi)及肺泡間隔可見(jiàn)炎性細(xì)胞滲出，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂漸漸加重，第7天時(shí)肺泡隔增寬達(dá)到高峰，肺組織炎性滲出、水腫及大量肺泡萎陷，第14天時(shí)肺泡隔仍增寬，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，滲出水腫慢慢消褪，成纖維細(xì)胞增生，纖維組織呈條索樣改變，片狀分布，肺損傷纖維化表現(xiàn)明顯；與高氧組比較，高氧+雷帕霉素組肺泡隔增寬更嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)及肺泡間隔炎性滲出更顯著，肺損傷纖維化表現(xiàn)更明顯；與高氧組和高氧+雷帕霉素組比較，高氧+OSI-027組肺泡隔增寬程度降低，肺泡腔內(nèi)及肺泡間隔炎性滲出減輕，肺損傷纖維化表現(xiàn)亦減輕，見(jiàn)圖1。

表1各組SD幼鼠的體重變化

Table 1.The changes of the body weight in different groups on different days (g. Mean±SD.n=6)

GroupDay 3Day 7Day 14Air55.3±6.578.8±7.7118.9±6.3 Hyperoxia48.0±2.7?51.4±4.6?67.1±5.4?Hyperoxia Rapa49.4±3.954.9±6.5?74.5±3.0?Hyperoxia OSI50.2±1.547.4±5.0?60.8±1.9?

*P<0.05vsair group.

Figure 1.The pathological changes of lung tissue in juvenile SD rats from each group (HE staining, ×400). →: neutrophils in the alveolar space;: proteinaceous debris filling the airspaces; {: alveolar septum thickness; >: proteinaceous debris filling the airspaces.

圖1各組SD幼鼠肺組織病理學(xué)改變

3 肺組織W/D的變化

第3、7和14天空氣組的肺W/D大致無(wú)改變。除空氣組外，其余各組不同時(shí)點(diǎn)肺組織W/D變化有顯著差異(F=25.836,P<0.01)，空氣組肺W/D顯著低于其它組(F=25.359,P<0.01)，從各時(shí)點(diǎn)看，除第14天外(F=2.61,P>0.05)，第3和7天各時(shí)點(diǎn)均以空氣組為最低(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2肺組織濕干重比的變化

Table 2.The changes of the wet and dry weight ratio (W/D) of the lung in different groups on different days (Mean±SD.n=6)

GroupDay 3Day 7Day 14Air4.73±0.134.75±0.114.74±0.17Hyperoxia5.08±0.15??5.41±0.18??4.93±0.16Hyperoxia Rapa5.09±0.13??5.48±0.17??5.00±0.20Hyperoxia OSI5.08±0.19??5.39±0.14??4.93±0.15

**P<0.01vsair group.

4 肺泡間隔寬度的變化

第3、7和14天隨著生長(zhǎng)發(fā)育，空氣組肺泡間隔寬度逐漸呈增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與空氣組比較，高氧組的肺泡間隔寬度顯著增加(P<0.05)，第7天時(shí)肺泡間隔寬度達(dá)到最高，而后降低，但第14天時(shí)肺泡間隔寬度仍顯著增加(P<0.05)；與高氧組比較，高氧+雷帕霉素組肺泡間隔寬度顯著增加(P<0.05)；與高氧組和高氧+雷帕霉素組比較，高氧+OSI-027組第3天時(shí)的肺泡間隔寬度無(wú)改變，第7和14天各時(shí)點(diǎn)高氧+OSI-027組肺泡間隔寬度顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3各組SD幼鼠的肺泡間隔寬度

Table 3.The changes of the alveolar septum width in different groups on different days (μm. Mean±SD.n=6)

GroupDay 3Day 7Day 14Air3.92±0.264.14±0.344.30±0.37Hyperoxia5.37±0.56?11.42±0.84?7.71±0.70?Hyperoxia Rapa5.55±0.70?14.98±0.76?&9.84±0.70?&Hyperoxia OSI5.10±0.53?8.65±0.90?&@5.92±0.78?&@

*P<0.05vsair group;&P<0.05vshyperoxia group;@P<0.05vshyperoxia Rapa group.

5 肺損傷評(píng)分的變化

第3、7和14天空氣組肺損傷評(píng)分的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與空氣組比較，高氧組的肺損傷評(píng)分增高(P<0.05)；與高氧組比較，高氧+雷帕霉素組的肺損傷評(píng)分增高(P<0.05);與高氧組和高氧+雷帕霉素組比較，高氧+OSI-027組的肺損傷減輕(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4各組SD幼鼠的肺損傷評(píng)分

Table 4.The changes of the lung injury score in different groups on different days (Mean±SD.n=6)

GroupDay 3 Day 7 Day 14 Air0.074±0.021 0.066±0.020 0.072±0.019 Hyperoxia0.335±0.038?0.593±0.038?0.797±0.032?Hyperoxia Rapa0.413±0.032?&0.645±0.023?&0.908±0.034?&Hyperoxia OSI0.289±0.018?&@0.535±0.030?&@0.735±0.023?&@

*P<0.05vsair group;&P<0.05vshyperoxia group;@P<0.05vshyperoxia Rapa group.

6 肺組織p-AKT1蛋白的分布

免疫組化結(jié)果顯示，第3天時(shí)在高氧組SD幼鼠肺組織中p-AKT1基本為陰性，偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞；與空氣組比較，第3、7和14天各時(shí)點(diǎn)在高氧組肺組織的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中p-AKT1陽(yáng)性細(xì)胞減少(P<0.05)；與高氧組比較，第3、7和14天各時(shí)點(diǎn)在高氧+雷帕霉素組和高氧+OSI-027組中p-AKT1陽(yáng)性細(xì)胞增多(P<0.05);與高氧+雷帕霉素組比較，第3、7和14天各時(shí)點(diǎn)在高氧+OSI-027組的p-AKT1陽(yáng)性細(xì)胞減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2、4。

7 肺組織p-S6K1蛋白的分布

在各組肺組織內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中p-S6K1呈陽(yáng)性表達(dá)；與空氣組比較，第3、7和14天各時(shí)點(diǎn)在高氧組肺組織中p-S6K1的陽(yáng)性表達(dá)增加(P<0.05)；與高氧組比較，第3、7和14天各時(shí)點(diǎn)在高氧+雷帕霉素組和高氧+OSI-027組肺組織中p-S6K1的陽(yáng)性表達(dá)下降(P<0.05)；與高氧+雷帕霉素組比較，第3、7和14天各時(shí)點(diǎn)在高氧+OSI-027組肺組織中p-S6K1的陽(yáng)性表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3、4。

8 肺組織 p-AKT1和p-S6K1蛋白含量的變化

空氣組隨著生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)p-AKT1蛋白水平明顯增加(P<0.05)，高氧組隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)p-AKT1的蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與空氣組比較，各時(shí)點(diǎn)在高氧組SD幼鼠肺組織中p-AKT1的蛋白水平降低(P<0.01)；與高氧組比較，各時(shí)點(diǎn)在高氧+雷帕霉素組和高氧+OSI-027組SD幼鼠的肺組織中p-AKT1的蛋白水平升高(P<0.05)；與高氧+雷帕霉素組比較，各時(shí)點(diǎn)在高氧+OSI-027組SD幼鼠肺組織中p-AKT1的蛋白水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

空氣組隨著生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)p-S6K1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，高氧組隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)p-S6K1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與空氣組比較，各時(shí)點(diǎn)p-S6K1在高氧組SD幼鼠肺組織中的表達(dá)量升高(P<0.01); 與高氧組比較，各時(shí)點(diǎn)p-S6K1在高氧+雷帕霉素組和高氧+OSI-027組SD幼鼠肺組織中的表達(dá)量降低(P<0.05)；與高氧+雷帕霉素組比較，各時(shí)點(diǎn)p-S6K1在高氧+OSI-027組SD幼鼠肺組織中表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖5。

Figure 2.Distribution of p-AKT1 protein in each group (×400).

圖2各組p-AKT1蛋白的分布

Figure 3.Distribution of p-S6K1 protein in each group (×400).

圖3各組p-S6K1蛋白的分布

Figure 4.The relative protein levels of p-AKT1 and p-S6K1 in different groups on day 3, day 7 and day 14 were detected by immunohistochemistry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsair group;#P<0.05vshyperoxia group;△P<0.05vshyperoxia Rapa group.

圖4免疫組織化學(xué)檢測(cè)第3、7和14天各組p-AKT1和p-S6K1蛋白的相對(duì)水平

討 論

高氧肺損傷的復(fù)雜病理生理過(guò)程主要表現(xiàn)為彌散性肺泡炎及肺損傷后修復(fù)重建，其病理學(xué)特征主要是細(xì)胞的壞死和凋亡，伴中性粒細(xì)胞滲出的肺泡炎性水腫及晚期的肺間質(zhì)增生和肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究組已在高氧肺損傷方面開(kāi)展了大量的相關(guān)研究[10]。本研究采用本實(shí)驗(yàn)室已成熟建立的高氧肺損傷動(dòng)物模型[11-12]，病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，高氧第14天時(shí)，肺損傷評(píng)分顯著增加，已出現(xiàn)肺間質(zhì)及成纖維細(xì)胞的增生。

mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinase,PI3K)蛋白家族，是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化、存活、生長(zhǎng)、翻譯、代謝及自噬的中心樞紐[13]。mTOR有功能不同的mTORC1和mTORC2 2個(gè)亞基。AKT1是mTORC2信號(hào)通路重要的下游靶蛋白，mTORC2具有激活A(yù)KT1的功能；AKT1又是mTOR的上游分子，可以激活mTOR，mTORC1下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：p-S6K1蛋白激酶能被雷帕霉素強(qiáng)烈抑制，但是4E-BP1磷酸化和自噬激活卻對(duì)雷帕霉素不敏感[14]。由于S6K1是mTORC1的直接作用底物，因此，p-S6K1被認(rèn)為是mTOR通路下游的重要效應(yīng)蛋白分子，其水平升高可反映mTOR信號(hào)通路的活化情況。mTOR激活能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，它在纖維化過(guò)程中扮演重要角色[15]。激活的AKT1參與細(xì)胞凋亡、葡萄糖代謝和蛋白質(zhì)合成過(guò)程，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和增殖[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)研究了肺組織pS6K1和p-AKT1 2種蛋白的表達(dá)水平。

AKT1與mTOR存在以下關(guān)系:一方面，AKT1可以直接使mTOR蛋白磷酸化而激活，促進(jìn)相關(guān)蛋白的表達(dá)；另一方面，AKT1可以間接使mTOR激活，激活的AKT1促進(jìn)結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex 2, TSC2)發(fā)生磷酸化，抑制TSC1/2復(fù)合物的形成，從而阻礙其對(duì)mTOR的抑制作用，另外，AKT1還可以磷酸化PRAS40，抑制PRAS40對(duì)mTOR的負(fù)性調(diào)節(jié)作用[17]。

有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素用于抗腫瘤治療時(shí)，可導(dǎo)致PI3K/AKT及Ras/Raf/ERK信號(hào)通路的激活，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[18]。正常狀況下，mTORC1活化導(dǎo)致S6K1活化，活化的S6K1可磷酸化IRS-1，從而反饋抑制PI3K的活化；mTORC1被抑制后，S6K1活化水平降低，反饋抑制機(jī)制被打破，從而導(dǎo)致PI3K的激活，PI3K激活后作用于下游的AKT1及Ras/Raf/ERK，導(dǎo)致其活化[19]，從而減弱雷帕霉素抑制細(xì)胞增殖的效果。同時(shí)，mTORC2對(duì)雷帕霉素不敏感，mTORC2的活化能夠激活A(yù)KT1，通過(guò)下游一些信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖[20-21]。

Figure 5.The relative protein levels of p-AKT1 and p-S6K1 in different groups on day 3 (A), day 7 (B) and day 14 (C) were detected by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsair group;#P<0.05,##P<0.01vshyperoxia group;△P<0.05vshyperoxia Rapa group.

圖5Westernblot檢測(cè)第3、7和14天各組p-AKT1和p-S6K1蛋白的相對(duì)水平

本實(shí)驗(yàn)免疫組化與Western blot的結(jié)果顯示相一致，空氣組和高氧組隨著生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)p-AKT1和p-S6K1蛋白表達(dá)明顯增加；與空氣組比較，各時(shí)點(diǎn)高氧組SD幼鼠高氧暴露后肺組織p-S6K1蛋白表達(dá)顯著增高，而肺組織p-AKT1蛋白水平顯著減少；與高氧組比較，各時(shí)點(diǎn)在高氧雷帕霉素組和高氧OSI-027組肺組織中p-S6K1表達(dá)明顯減少，而肺組織中p-AKT1表達(dá)明顯增多，提示高濃度氧可激活mTOR/S6K1信號(hào)途徑，降低AKT1的磷酸化，抑制mTOR信號(hào)通路能升高AKT1的磷酸化。

綜上所述，mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素不能減弱高氧致SD幼鼠肺損傷纖維化的作用，mTORC1和mTORC2雙重抑制劑OSI-027能減輕高氧致SD幼鼠肺損傷纖維化的作用。本研究提示p-AKT1可能參與了高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展，激活A(yù)KT1有促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖的作用，其調(diào)控機(jī)制可能與mTOR信號(hào)通路有關(guān)。但細(xì)胞間復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通常伴有通訊串?dāng)_，單一信號(hào)通路的改變并不能完全闡明高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。有關(guān)p-AKT1在高氧肺損傷纖維化中的具體作用和機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。