唐 瑜，孫士林，尹雙雙，彭哲宇，曾憲剛，姚姝婷，何鈺婷，彭 娜

(成都醫(yī)學院 1基礎醫(yī)學院, 2體溫與炎癥四川省高校重點實驗室, 3檢驗醫(yī)學院， 四川 成都 610500)

精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)作為一種內(nèi)分泌九肽激素，在自主神經(jīng)功能中發(fā)揮著重要作用，比如參與心血管活動調(diào)節(jié)和體溫調(diào)節(jié)[1]。AVP受體是G蛋白偶聯(lián)受體，包括V1a、V1b和V2共3種亞型，其中V1a受體激活磷脂酶C (phospholipase C，PLC)信號通路，引起細胞內(nèi)鈣離子濃度升高并激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)[2]。整體動物實驗研究表明，外源性AVP會引起動物體溫降低，而注射V1a受體抑制劑可升高體溫[3]; 其對體溫的緊張性負調(diào)節(jié)作用可能與AVP改變視前區(qū)(preoptic area, POA)神經(jīng)元放電活動和溫度敏感性有關[4]。

中樞控制體溫調(diào)節(jié)反應涉及視前區(qū)神經(jīng)元協(xié)調(diào)整合中樞和外周溫度信號[5]。皮膚感覺的冷/熱信號分別傳遞到背根神經(jīng)節(jié)后傳入到脊髓后角。臂旁外側(cè)核的外側(cè)亞核(external lateral subnucleus of la-teral parabrachial nucleus，LPBel)和背側(cè)亞核(dorsal subnucleus of lateral parabrachial nucleus，LPBd)分別接受脊髓后角傳來的冷和熱信號[6]。冷激活神經(jīng)元從LPBel投射到正中視前核，然后通過這里分布的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能中間神經(jīng)元再投射到內(nèi)側(cè)視前區(qū)，控制可以調(diào)節(jié)皮膚血管收縮、棕色脂肪組織代謝和戰(zhàn)栗產(chǎn)熱的熱敏神經(jīng)元[7]。內(nèi)側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元接受GABA能突觸傳遞的緊張性抑制，這可調(diào)制內(nèi)側(cè)視前區(qū)熱敏神經(jīng)元的放電活動和溫度敏感性[8]。激活外側(cè)視前核的腹側(cè)GABA能神經(jīng)元可以降低體溫，同時伴有大鼠活動度的減少[9]。最近我們發(fā)現(xiàn)，AVP差異性地調(diào)制視前區(qū)溫度敏感和不敏感神經(jīng)元的抑制性突觸后電流[10]，但是具體作用機制尚不清楚。本實驗應用RT-qPCR和Western blot法，探討精氨酸加壓素對大鼠視前區(qū)GABAA受體亞單位(α、β和γ2)表達和磷酸化的作用。

材 料 和 方 法

1 動物

應用SPF級健康雄性SD大鼠，體重200～250 g(6～7周齡)，由成都達碩實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(川)2015-030。在飼養(yǎng)時大鼠可自由進食和飲水，控制環(huán)境溫度在24～26 ℃，相對濕度在60%～65%，保持12 h晝/12 h夜節(jié)律。

2 主要試劑

RNAlater和TRIzol(Invitrogen)；DEPC(Sigma)；PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa); FastStart Essential Probes Master(Roche)；TEMED 、RIPA裂解液和PMSF(上海碧云天生物技術有限公司)；BCA蛋白含量檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；4×上樣緩沖液(BIO-RAD)；蛋白Marker(Thermo Fisher)；ECL化學發(fā)光試劑盒(Millipore)；熒光定量PCR探針(Roche)，探針所匹配的特異引物由成都梓熙擎科生物技術公司合成，見表1；所用抗體及稀釋濃度見表2。

表1 RT-qPCR探針及引物序列

UPL: Universal ProbeLibrary.

3 主要方法

3.1實驗分組、給藥及取材 實驗SD大鼠隨機分為4組(n=10),分別為對照(control)組(saline+saline)、AVP組(saline+AVP)、V1a受體抑制劑(V1a receptor antagonist,V1a Anta)+AVP組和V1a受體抑制劑組(V1a Anta+saline)。每組動物均腹腔注射2次，第1次注射V1a受體抑制劑(30 μg/kg)或等量的生理鹽水，20 min后第2次注射AVP(10 μg/kg)

表2 抗體名稱、稀釋比和來源

或等量的生理鹽水，30 min后腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉(1 mL/kg)，快速斷頭處死。取腦組織放入冰水混合的人工腦脊液中，修塊后用502膠將組織塊固定在振動切片機上，切成300 μm厚的水平下丘腦片，在體視顯微鏡下分離POA組織，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，進行后續(xù)的分子生物學實驗。

3.2RT-qPCR實驗 參照TRIzol試劑說明書嚴格操作，獲得RNA樣本后測定RNA 濃度及純度。電泳檢測RNA 完整性，可見明亮的28S、18S 及較淡5S 3條帶，無DNA 污染條帶。隨后冰上制備RT反應體系，先去基因組DNA，反應體系為：5× gDNA Era-ser 緩沖液 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 2 μg，加無酶水至總體系為10 μL?；靹螂x心后轉(zhuǎn)至PCR儀，42 ℃孵育2 min。然后在體系內(nèi)加入10 μL的反轉(zhuǎn)錄預混液，該預混液含：PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 4 μL，5× PrimeScript Buffer 24 μL，RNase-free dH2O 1 μL?；靹螂x心后在PCR儀內(nèi)反應：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA用于qPCR，配制預混液比例為每10 μL反應體系含F(xiàn)astStart Essential Probes Master 5 μL、引物及探針各0.15 μL和RNase-free dH2O 1 μL，渦旋混勻后分裝于八聯(lián)管，加入2 μL cDNA模板，再次混勻離心后上機。擴增程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,讀取熒光值，循環(huán)45次；最后40 ℃延伸30 s。反應結(jié)束后，以β-actin為內(nèi)參照，使用2-ΔΔCt法計算各組mRNA相對含量。

3.3Western blot實驗 按照組織∶裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)=1 g∶5 mL的比例，冰上裂解組織30 min。離心后取上清，并按1∶20稀釋。嚴格按照BCA蛋白定量試劑盒說明書完成蛋白定量。PSD中加入4×樣品緩沖液，煮沸5 min，取100 μg蛋白上樣，用8% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)至經(jīng)甲醇活化的PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃恒溫振蕩封閉1 h，TBST漂洗后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉稀釋的Ⅰ抗(表2)，水平搖床4 ℃孵育過夜。TBST再次漂洗，用經(jīng)5%脫脂奶粉稀釋過的辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗(表2)37 ℃恒溫孵育2 h，TBST漂洗后滴上發(fā)光液，放入凝膠成像儀中顯影。用凝膠圖像分析系統(tǒng)測定條帶的相對灰度，結(jié)果以目的蛋白相對表達量表示。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。不同組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗，方差齊則采用Dunnett檢驗，方差不齊則采用Tamhane’s T2檢驗。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析由SPSS 19.0統(tǒng)計軟件完成，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 AVP不影響視前區(qū)GABAA受體mRNA表達

除β3亞單位外，AVP有增加其它亞單位mRNA表達的趨勢，而V1a受體抑制劑減弱了這種趨勢。但與對照組相比，AVP組、V1a受體抑制劑+AVP組和V1a受體抑制劑組GABAA受體亞單位mRNA變化均沒有統(tǒng)計學意義，見圖1。

2 AVP通過V1a受體激活PKC和CaMKⅡ

與對照組相比，外源性AVP顯著增強大鼠視前區(qū)組織PKC和CaMKⅡ表達及磷酸化(P<0.01)，這一效應可以被V1a受體抑制劑消除(P<0.01);單獨注射V1a受體抑制劑還可以通過阻斷內(nèi)源性AVP減少PKC和CaMKⅡ表達及磷酸化(P<0.01),見圖2。

3 AVP通過V1a受體磷酸化GABAA受體γ2亞單位

與對照組比較，AVP組、V1a受體抑制劑+AVP組和V1a受體抑制劑組GABAA受體亞單位(α、 β和γ2)蛋白變化沒有統(tǒng)計學意義。但外源性AVP顯著增加GABAA受體γ2亞單位磷酸化水平，這一作用可以被V1a受體抑制劑所消除(P<0.05)，而阻斷內(nèi)源性AVP并不會引起其磷酸化的減少,見圖3。

討 論

作為一種激素或神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)，AVP在體溫的緊張性負調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[1]。本課題組前期研究表明，AVP可以調(diào)節(jié)視前區(qū)熱敏神經(jīng)元的自發(fā)放電活動和溫度敏感性，而對冷敏和溫度不敏感神經(jīng)元卻有相反的作用[4]，這些結(jié)果提示AVP可以通過V1a受體興奮視前區(qū)熱敏神經(jīng)元而抑制冷敏神經(jīng)元的活動。視前區(qū)是重要的調(diào)節(jié)體溫中樞，溫度敏感神經(jīng)元通過控制機體產(chǎn)熱與散熱反應調(diào)節(jié)體溫，這可從電生理角度解釋AVP對體溫的緊張性負調(diào)節(jié)作用。視前區(qū)神經(jīng)元的自發(fā)放電活動還受外周溫度傳入信號的調(diào)制。因此，我們最近研究表明，AVP差異性調(diào)制視前區(qū)溫度敏感和不敏感神經(jīng)元抑制性突觸后電流[10]。但灌流正常人工腦脊液時，這些不同溫度敏感類型神經(jīng)元的抑制性突觸后電流幅度和頻率并沒有顯著差異。這提示AVP可能通過不同機制調(diào)制視前區(qū)熱敏神經(jīng)元、冷敏感神經(jīng)元和溫度不敏感神經(jīng)元抑制性突觸傳遞活動。

Figure 1.Effects of AVP and V1a receptor antagonist (V1a Anta) on GABAAreceptor subunit mRNA levels in POA tissues of rats. Mean±SEM.n=6.

圖1AVP和V1a受體抑制劑對視前區(qū)組織GABAA受體mRNA表達的影響

Figure 2.AVP activated PKC and CaMKII in rat POA tissues. Mean±SEM.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAVP group.

圖2AVP激活視前區(qū)組織PKC和CaMKII

與外側(cè)隔區(qū)、海馬和舌下運動神經(jīng)元記錄的抑制性突觸后電流相似[2,11]，AVP調(diào)制的視前區(qū)神經(jīng)元抑制性突觸后電流是由GABAA受體介導[10]。GABAA受體是異質(zhì)寡聚體跨膜蛋白，由5個亞基聚合而成，氯離子通道位于5個亞基的中心?，F(xiàn)已在哺乳類動物大腦中鑒定的GABAA受體亞基有21種，分8個亞基族，分別為α1～6、β1～4、γ1～4、ρ1～3、δ、ε、π和θ。不同亞基組合受體的功能會有所差異，展現(xiàn)出不同的生理學和藥理學特性。一般情況下，構(gòu)成受體的5個亞基由2個α亞基、2個β亞基或1個γ亞基組成。哺乳動物大腦中構(gòu)成天然GABAA受體的亞基主要是α、β和γ，以α1、β2和γ2 3種亞基以2∶2∶1的比例組成的GABAA受體為主[12-13]。有單細胞轉(zhuǎn)錄組分析報道視前區(qū)熱敏神經(jīng)元表達GABAA受體亞單位主要為α2、α3、β2和 γ2[14]。本研究檢測到視前區(qū)表達GABAA受體亞單位α1、α2、α3、β2、β3和γ2 mRNA，印證了上述結(jié)果。

Figure 3.AVP phosphorylated the GABAAreceptor γ2 subunit in rat POA tissues. Mean±SEM.n=4.*P< 0.05vscontrol group;#P<0.05vsAVP group.

圖3AVP磷酸化視前區(qū)組織GABAA受體γ2亞單位

AVP受體主要有3種，V1a、V1b和V2受體，最早分別在血管平滑肌、垂體、腎臟遠曲小管和集合管發(fā)現(xiàn)[1]。電生理結(jié)果證實V1a受體阻斷劑可消除AVP對視前區(qū)神經(jīng)元抑制性突觸后電流的調(diào)制作用[10]。激活V1a受體，通過PLC信號通路引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高并激活PKC和CaMKII[1]。AVP抑制視前區(qū)神經(jīng)元GABAA受體的機制可能涉及3方面：首先，激活V1a受體調(diào)節(jié)GABAA受體表達；其次，PKC或CaMKII通過磷酸化調(diào)制GABAA受體功能[15-16]；最后, PKC磷酸化引起GABAA受體內(nèi)化，減少膜上表達[17]。本實驗證實在視前區(qū)表達GABAA受體亞單位α1、α2、α3、β2、β3和γ2。但RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果并不支持AVP通過激活V1a受體調(diào)節(jié)GABAA受體基因和蛋白表達。這可能和實驗取材有關，實驗取的視前區(qū)組織既含有熱敏神經(jīng)元，也有冷敏和溫度不敏感神經(jīng)元，無法分離單一溫度敏感類型的神經(jīng)元。由于AVP可以差異性調(diào)制視前區(qū)溫度敏感和不敏感神經(jīng)元抑制性突觸后電流，所以我們推測AVP可能下調(diào)GABAA受體在熱敏、冷敏神經(jīng)元、中等斜率溫度不敏感神經(jīng)元和部分低斜率溫度不敏感神經(jīng)元的表達，而上調(diào)其在另外部分低斜率溫度不敏感神經(jīng)元的表達。因此，在后續(xù)的研究中可以通過單細胞RT-PCR或轉(zhuǎn)錄組技術，進一步證實AVP是否引起不同溫度敏感類型神經(jīng)元GABAA受體mRNA表達的差異。

本實驗結(jié)果提示AVP提高了視前區(qū)PKC磷酸化水平。PKC通過磷酸化通道可以減少GABA引起的抑制性突觸后電流幅度而不影響電流衰減時間常數(shù)[15]，而近期課題組顯示AVP降低熱敏、冷敏神經(jīng)元抑制性突觸后電流幅度，卻沒有改變其通道動力學參數(shù)[10]，這提示V1a受體激活的PKC可能對視前區(qū)熱敏神經(jīng)元和冷敏神經(jīng)元的GABAA受體磷酸化水平產(chǎn)生影響，從而引起AVP對電流幅度的抑制而不改變通道動力學參數(shù)。抑制性突觸后電流幅度的減少與PKC磷酸化GABAA受體β1 (S409)、β3和γ2 (S327和S343)亞單位有關[12,15]。本實驗也證實了這一觀點，AVP引起視前區(qū)組織GABAA受體γ2亞單位磷酸化水平增加。

本實驗結(jié)果還提示AVP引起視前區(qū)CaMKII磷酸化水平升高。CaMKII的激活可以通過2個方面影響GABAA受體[13, 16]：第一，通過磷酸化含有β3亞單位受體的β3(S383)和γ2(Y365/7)，增加抑制性突觸后電流時間；第二，通過磷酸化促進受體從囊泡上膜，使含有β2亞單位的受體電流幅度增加而不改變通道動力學參數(shù)[18-19]。這可部分解釋AVP增加視前區(qū)低斜率溫度不敏感神經(jīng)元抑制性突觸后電流幅度并且影響通道動力學參數(shù)[10]。

綜上所述，本研究證實AVP通過V1a受體激活PKC和CaMKII，影響視前區(qū)GABAA受體γ2亞單位磷酸化水平，而不改變受體mRNA和蛋白表達。這可能是AVP差異性地調(diào)制視前區(qū)神經(jīng)元GABA能突觸傳遞的分子機制之一。