呂 瑤,肖國輝,王天剛,陳珊珊,趙 龍

（西南醫(yī)科大學(xué)：1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院；2附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，四川瀘州 646000）

作為消化系統(tǒng)的危急重癥之一，重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的病因與診治經(jīng)歷了長時期的探索，盡管近年來其病死率明顯下降，但我們對其發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全明確，治療也是臨床上的一大難點；因其不僅是胰腺自身的炎癥，更是引起全身多個臟器損害的全身性疾病，可引起多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syn?drome，MODS)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic in?flammatory response syndrome，SIRS)等。SAP 發(fā)病過程中多并發(fā)肝腎損害，且發(fā)生較早。Halonen 等[1]在一項回顧性研究中發(fā)現(xiàn)：重癥急性胰腺炎并發(fā)肝損傷的比率很高，達88.9%，并且以肝、腎功能衰竭最為嚴重，死亡率最高。柴黃清胰活血顆粒具有瀉熱通腑、清熱解毒、行氣止痛、活血化瘀的功效。其臨床療效明確，前期實驗證實，柴黃清胰活血顆粒對重癥急性胰腺炎模型大鼠有明顯的治療作用[2]。本實驗通過探討柴黃清胰活血顆粒對重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺及胰外器官（肝、腎）的治療作用，為該藥的臨床運用和新藥研究提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD 大鼠54 只，10 周齡，體重為280～320 g[購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2015-030]。

1.2 實驗藥物及劑量

柴黃清胰活血顆粒主要由生大黃、柴胡、黃芩、梔子、枳實、厚樸、桃仁、赤芍、蒲公英等十四味組成，成藥由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室研制提供。批號:20181015。按照公式：大鼠劑量（g/kg）=W×人體劑量（g/kg）,W=6.25，成年人體重取60 kg，一次10 g,換算得出：大鼠常規(guī)使用劑量為：0.1 g/100 g,根據(jù)前期實驗證實：柴黃清胰活血顆粒療效呈劑量依賴性，其中高劑量組療效更好，本次實驗直接采用高劑量（0.2 g/100 g）作為中藥組（CHQY 組）使用劑量[1]。

1.3 試劑

?；悄懰徕c(Solarbio 公司，批號:20171113)，配制成3.5%?；悄懰徕c溶液。蘇木素染液(北京百靈威科技有限公司，批號：20160114)，4%多聚甲醛中性固定液（biosharp公司,批號：1810473）等。

1.4 實驗方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機分為3 個組，即sham 組、SAP 組、CHQY 組，每組分為6 h、12 h、24 h三個時點，每個時點6 只，術(shù)前禁食12 h,自由飲水。Sham 組開腹后僅翻動腸管即關(guān)閉腹腔。SAP 組及CHQY組采用經(jīng)十二指腸逆行胰膽管注射3.5%牛磺膽酸鈉建立重癥急性胰腺炎模型。具體方法：大鼠稱重，用3%戊巴比妥鈉液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后固定于手術(shù)臺，腹部剃毛，消毒,鋪巾，沿腹部正中線劍突下作1條長約3 cm 手術(shù)切口開腹，找到十二指腸及胰腺，用動脈夾夾閉肝總管防止?；悄懰徕c進入肝臟，用4.5號磨鈍皮試針頭沿十二指腸乳頭對側(cè)十二指腸偏下方無血管區(qū)緩慢進入胰膽管，動脈夾夾閉針頭入胰膽管處防止反流，緩慢勻速注射牛磺膽酸鈉（0.1 mL/100 g）,注射完畢后取出動脈夾并逐層關(guān)腹，術(shù)后予以皮下注射生理鹽水（4 mL）補充術(shù)中失水，術(shù)后予以保暖。麻醉蘇醒后，Sham 組與SAP 組予以灌胃生理鹽水（1 mL/100 g）,CHQY組予以灌胃柴黃清胰活血顆粒（0.2 g/100 g，并用生理鹽水稀釋為1 mL/0.2 g），每組每4 h灌胃1次。

1.5 標(biāo)本采集

分別在術(shù)后6 h、12 h、24 h各處死6只大鼠并取材，取腹主動脈血約3～5 mL，靜置1 h后離心，取血清存于-20 ℃冰箱以備檢測AMS、AST、ALT、Scr、BUN；分別取胰腺、肝、腎，用冰生理鹽水沖洗后迅速放入4%多聚甲醛固定液中固定，以備HE染色，行病理檢查。

1.6 指標(biāo)測定

血清AMS、AST、ALT、Scr、BUN均由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科全自動生化分析儀檢測。胰腺、肝、腎組織進行組織脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色、樹膠封片，最后在光鏡下觀察，進行病理學(xué)評分。胰腺病理評分采用Rongione評分標(biāo)準(zhǔn)[3]：按照水腫、炎癥浸潤、出血、壞死四個方面進行評分，每個方面根據(jù)嚴重程度分別評0分、1分、2分、3 分、4 分。肝、腎病理評分參考田在善[4]的標(biāo)準(zhǔn)，按嚴重程度分為正常、輕、中、重，分別評0 分，1 分，2分，3分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清淀粉酶活性變化

與Sham 組相比，SAP 組及CHQY 組在各個時點血清淀粉酶活性均顯著升高（P＜0.05）；與SAP組比較，CHQY 組6 h 組淀粉酶活性無差異，12 h、24 h 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 三組大鼠不同時間點血清淀粉酶比較(±s，U/L)

表1 三組大鼠不同時間點血清淀粉酶比較(±s，U/L)

注：a與Sham組相比，P＜0.05；b與SAP組相比，P＜0.05

2.2 大鼠血清AST、ALT活性變化

與Sham 組各時點比較，SAP 組、CHQY 組AST、ALT活性均明顯升高（P＜0.05），CHQY組12 h、24 h與SAP 組相應(yīng)時點比較，血清ALT 水平明顯降低(P＜0.05)。與SAP 組比較，CHQY 組各時點AST 水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 三組大鼠不同時間點血清AST、ALT比較(±s，U/L)

表2 三組大鼠不同時間點血清AST、ALT比較(±s，U/L)

注：a與Sham組相比，P＜0.05；b與SAP組相比，P＜0.05

2.3 大鼠血清BUN、Scr活性變化

與Sham 組各時點比較，SAP 組、CHQY 組BUN、Scr 活性均明顯升高（P＜0.05），CHQY 組12 h、24 h與SAP 組相應(yīng)時點比較，血清BUN 水平明顯降低（P＜0.05）。與SAP 組比較，CHQY 組各時點Scr 水平均降低（P＜0.05）。（見表3）

表3 三組大鼠不同時間點血清BUN、Scr比較(BUN:±s，mmol/L，n=6;Scr:±s，μmol/L)

表3 三組大鼠不同時間點血清BUN、Scr比較(BUN:±s，mmol/L，n=6;Scr:±s，μmol/L)

注：a與Sham組比較，P＜0.05；b與SAP組比較，P＜0.05

2.4 剖腹后大體觀察

Sham組各時點大鼠腹腔無明顯積液，腸腔無充氣，胰腺無充血、水腫及壞死，未見皂化斑，胰腺與周圍組織輕微粘連。SAP組各時點大鼠腹腔大量紅黃色積液，腸管腫脹充血，胰腺腫脹、壞死、充血，胰腺及腹腔網(wǎng)膜可見大量黃白色皂化斑，胰腺與肝、脾、腸管粘連明顯，且隨時間的推移加重。CHQY 組各時點腹腔積液較SAP組減少，胰腺腫脹、充血較SAP組有所減輕，胰腺周圍及網(wǎng)膜可見少量皂化斑，胰腺與周圍器官組織粘連。

2.5 胰腺病理組織學(xué)觀察

Sham組各時點大鼠胰腺除個別有輕度水腫，少量炎細胞浸潤，大部分胰腺結(jié)構(gòu)基本完整，未見水腫、出血、壞死（見圖1）。SAP 組大鼠胰腺水腫，胰腺腺泡壞死，小葉結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)分隔小葉，胞漿內(nèi)可見空泡形成，壞死區(qū)周圍可見大量中性粒細胞及單核細胞浸潤；胰腺間質(zhì)內(nèi)可見大量的紅細胞滲出、大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，且隨時間的推移，胰腺的炎癥程度加重（見圖2～4）。CHQY 組各時點大鼠胰腺輕微水腫，部份胰腺腺泡壞死，結(jié)構(gòu)稍模糊，壞死周圍炎癥細胞浸潤較SAP 組輕，胰腺間質(zhì)內(nèi)可見少許紅細胞浸潤（見圖5～7）。

圖1 Sham組(HE染色×400)

圖2 SAP組6 h(HE染色×400)

圖3 SAP組12 h(HE染色×400)

圖4 SAP組24 h(HE染色×400)

圖5 CHQY組6 h(HE染色×400)

圖6 CHQY組12 h(HE染色×400)

圖7 CHQY組24 h(HE染色×400)

2.6 胰腺組織病理學(xué)評分

SAP 組各時點胰腺病理學(xué)評分顯著升高（P＜0.05），且隨時間的推移嚴重程度越重，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CHYQ組12 h、24 h與SAP組對應(yīng)時點比較，胰腺組織的病理學(xué)評分明顯降低（P＜0.05），6 h 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），（見表4）。

表4 三組大鼠不同時間點胰腺組織病理學(xué)評分(±s)

表4 三組大鼠不同時間點胰腺組織病理學(xué)評分(±s)

注：a與sham組相比，P＜0.05；bSAP組相比，P＜0.05

2.7 肝、腎組織的病理學(xué)觀察

正常組大鼠肝組織可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列整齊，無空泡、出血、壞死及炎細胞浸潤（見圖8）。SAP 組可見細胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，大量空泡形成，可見壞死細胞、充血及炎細胞浸潤，血竇擴張，肝索排列紊亂（見圖9～11）。CHQY組大鼠肝組織空泡及壞死均減少，肝小葉結(jié)構(gòu)稍紊亂，滲出及浸潤較SAP 組明顯減少（見圖12～14）。Sham組大鼠腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)清晰、腎間質(zhì)無水腫、腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)完整，無或少量炎細胞浸潤，無充血及壞死（見圖15）；與假手術(shù)組比較，SAP組大鼠腎小球萎縮，大量炎細胞及紅細胞浸潤，腎小管管腔內(nèi)大量淤血，管型形成，腎小管管腔變窄（見圖16～18）；CHQY 組大鼠腎皮質(zhì)細胞損傷減輕，腎小球萎縮、紅細胞及炎細胞浸潤、腎小管管腔變窄、管型形成等病理損害較SAP組減輕（見圖19～21）。

圖8 Sham組(HE染色×100)

圖9 SAP組6 h(HE染色×100)

圖10 SAP組12 h(HE染色×100)

圖11 SAP組24 h(HE染色×100)

圖12 CHQY組6 h(HE染色×100)

圖14 CHQY組24 h(HE染色×100)

圖15 Sham組(HE染色×100)

圖16 SAP組6 h(HE染色×100)

圖17 SAP組12 h(HE染色×100)

圖18 SAP組24 h(HE染色×100)

圖19 CHQY組6 h(HE染色×100)

圖20 CHQY組12 h(HE染色×100)

圖21 CHQY組24 h(HE染色×100)

2.8 肝、腎組織的病理學(xué)評分

SAP 組各時點肝組織、腎組織病理學(xué)評分較Sham組明顯升高（P＜0.05）。CHYQ組6 h、12 h、24 h與SAP 組對應(yīng)時點比較，肝組織的病理學(xué)評分明顯降低（P＜0.05）。CHQY 組12 h、24 h 與SAP 組對應(yīng)時點比較，腎組織的病理學(xué)評分降低（P＜0.05）（見表5）。

表5 三組大鼠不同時間點肝腎組織的病理學(xué)評分(±s)

表5 三組大鼠不同時間點肝腎組織的病理學(xué)評分(±s)

注：a與Sham組比較，P＜0.05；b與SAP組比較，P＜0.05

3 討論

SAP 極容易合并多器官功能損害，其中肝腎損害，尤其是肝衰竭、腎衰竭是其中最常見、最嚴重的胰外器官損害,是導(dǎo)致SAP 患者死亡的最主要原因之一。研究表明，SAP 的嚴重程度與肝損傷的嚴重程度呈正相關(guān)，肝損傷不僅能加重SAP的炎癥反應(yīng)，并且對其余器官，如腎和肺的損傷起著促進作用[4]。關(guān)于SAP能并發(fā)嚴重的肝損傷主要是基于以下3個原因:首先胰腺與肝臟相鄰，胰腺的大量炎性滲出液波及肝臟導(dǎo)致肝損傷；其次肝臟是全身血流最豐富的器官，SAP 病程中產(chǎn)生的大量炎性細胞因子及內(nèi)毒素等通過靜脈血流入肝臟，加重肝臟的損傷；最后肝臟是全身最大的代謝及解毒器官，肝實質(zhì)的損害導(dǎo)致肝臟對炎癥介質(zhì)及細胞因子的解毒和清除作用明顯下降，進一步加重病情[5]。SAP并發(fā)腎損害的機制尚未完全明確，過去認為與SAP 發(fā)病過程中有效循環(huán)血容量不足及微循環(huán)障礙，腎臟灌注不足所引起的缺血性損傷有關(guān)，近年來研究表明，SAP并發(fā)腎損害主要是由于SAP 致大量促炎因子釋放進入血液，引起強烈的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）所致[6]，若發(fā)展至急性腎衰竭（ARF）后預(yù)后更差。因此，有效地預(yù)防或減輕肝腎功能的損傷對改善重癥急性胰腺炎患者預(yù)后和提高生存率具有重要意義。

SAP 組各時點大鼠剖腹后腹水明顯增多，胰腺腫脹、充血，腹腔臟器粘連明顯，網(wǎng)膜見大量皂化斑，血清AMS顯著升高，胰腺病理學(xué)評分升高，提示SAP模型成功建立。SAP 組ALT、AST、BUN、Scr 較Sham組顯著升高，肝組織及腎組織病理學(xué)評分升高，提示該SAP模型并發(fā)肝腎損害。CHQY組大鼠剖腹后腹腔腹水、網(wǎng)膜上的皂化斑較SAP 組減輕，血清AMS及胰腺病理組織學(xué)評分均低于SAP 組，提示柴黃清胰活血顆粒能改善胰腺組織的病理學(xué)評分，對SAP模型大鼠具有治療作用。AST、ALT、BUN、Scr 是分別反應(yīng)肝腎功能損害程度的重要指標(biāo)，CHQY 組大鼠血清的AST、ALT、BUN、Scr值均降低，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)CHQY組肝小葉壞死、炎細胞浸潤、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂等均較SAP 組減輕；CHQY 組的腎組織腎小球萎縮程度、紅細胞及炎細胞浸潤等病理損害均較SAP組減輕。可見柴黃清胰活血顆粒能改善SAP模型大鼠的肝腎損傷，對多器官功能具有保護作用。

SAP 屬于中醫(yī)“胃脘痛”、“腹痛”、“脅痛”等范疇，中醫(yī)臨床診療術(shù)語疾病部分國家標(biāo)準(zhǔn)稱之為“胰癉”。SAP 早期主要臨床表現(xiàn)為：腹痛、惡心、嘔吐、腹脹、肛門停止排便排氣及腹膜炎等，這與《傷寒論》描述的陽明腑實證—痞、滿、燥、實、堅等證候相吻合。經(jīng)過多年臨床實踐總結(jié)，目前多數(shù)醫(yī)家認為其病機為濕熱壅滯、腑氣不通、毒瘀互結(jié)。其中濕熱壅滯是重癥急性胰腺炎最主要的病理機制。針對急性胰腺炎的主要病機，我院脾胃病專家、四川省名中醫(yī)周德端教授提出了“通腑瀉熱解毒、除濕散瘀止痛”的治療原則，在此法的指導(dǎo)下形成了中藥綜合治療方案：用胰癉1 號、胰癉2 號管胃（口服）、灌腸，配合西醫(yī)基礎(chǔ)治療，臨床療效確切，能縮短病程、減少并發(fā)癥，降低病死率，值得進一步研究和推廣[7]。為了更好的總結(jié)周德端教授治療SAP的學(xué)術(shù)思想和用藥規(guī)律，提供更安全可靠、簡便有效的治療藥物，現(xiàn)已將該方制成顆粒制劑—“柴黃清胰活血顆?！薄７街幸陨簏S為君藥以泄熱通腑；柴胡為臣藥以疏肝行氣；黃芩、梔子、蒲公英清熱解毒；枳實、厚樸助柴胡、大黃下氣消脹；延胡索理氣活血；丹參、桃仁、赤芍活血祛瘀；白芍緩急止痛，黃芪益氣托毒，甘草為使藥調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏瀉熱通腑、清熱解毒、行氣止痛、活血化瘀之功。現(xiàn)代藥理研究表明，方中所含藥物大多具有抗炎、抗菌的作用，對SAP有確切的治療作用。大黃游離蒽醌類物質(zhì)是大黃的主要活性成分，有研究表明大黃游離蒽醌能抑制全身炎癥反應(yīng)，減輕肝臟損傷,對重癥急性胰腺炎所致的肝損傷有保護作用[8]。厚樸的主要作用成分為厚樸酚、和厚樸酚，陳銀芳等人發(fā)現(xiàn)大黃素、蘆薈大黃素、厚樸酚、和厚樸酚的組方對AP大鼠有明顯治療作用,因其能夠調(diào)節(jié)NF-κB 蛋白的表達，抑制炎癥反應(yīng)[9]。另有研究表明黃芩具有抗炎、抗菌、抗氧化、增強機體免疫的作用[10]。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷也具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎的作用，還可以通過對信號通路的調(diào)控,達到抗肝損傷的作用[11]。

4 結(jié)論

柴黃清胰活血顆粒不僅對SAP 具有治療作用，對SAP 并發(fā)的肝腎損傷亦具有保護作用，其保護機制值得進一步深入研究。