敬 敏，張國(guó)平，吳 歡，王 瑜，劉貴平，谷從陽(yáng)

（內(nèi)江市第一人民醫(yī)院：1病理科；2肝膽外科，四川內(nèi)江 641000）

我國(guó)肝癌的發(fā)病率居世界首位[1]，HCC為主要病理類(lèi)型，這與我國(guó)HBV感染有關(guān)。手術(shù)治療近期療效確切，但腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響其遠(yuǎn)期療效[2]。因此尋找影響HCC 進(jìn)展的基因及蛋白分子對(duì)提升臨床療效十分重要。近年的研究表明腫瘤組織中存在的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是影響腫瘤形成及侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因[3]。肝癌干細(xì)胞(1iver cancer stem cells，LCSCs)是存在于HCC 組織中的CSCs，與HCC 的形成、進(jìn)展及復(fù)發(fā)相關(guān)[4-5]。CD133是LCSCs的標(biāo)記物之一，在HCC組織中高表達(dá)，與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。CD44是另一種LCSCs的表面標(biāo)記分子，其表達(dá)與腫瘤的分期有關(guān),并可影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)43例HCC組織中CD133和CD44蛋白的表達(dá)，探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2015年6月至2018年9月經(jīng)本院肝膽外科手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的43 例HCC 患者的腫瘤組織標(biāo)本，其中男性24 例、女性19 例、年齡47～75 歲、中位數(shù)年齡61歲。所有患者均有HBV感染背景，行手術(shù)切除前未接受腫瘤相關(guān)的其他治療。病例隨訪至死亡或截止時(shí)間為2018 年9 月，共隨訪3～36 月。入選病例均有完整的臨床及隨訪資料。臨床資料包括年齡、性別、腫瘤直徑、甲胎蛋白量、分化程度、門(mén)脈癌栓及臨床分期。收集癌旁組織（距腫瘤距離均＞2 cm）標(biāo)本36例作為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑

CD133 單克隆抗體（鼠抗人）購(gòu)自Santa Cruz 公司，CD44 單克隆抗體（鼠抗人）購(gòu)自北京中杉金橋公司，DAB 顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。其他所需試劑如蒸餾水、雙氧水等由內(nèi)江市第一人民醫(yī)院病理科提供。

1.2.2 免疫組化

所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)固定、包埋，4 μm 連續(xù)切片。按試劑說(shuō)明的操作步驟進(jìn)行CD133 和CD44 分子的免疫組化檢測(cè)。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（試劑公司提供的陽(yáng)性切片）和陰性對(duì)照（PBS代替一抗）。

1.3 結(jié)果判定

CD133和CD44蛋白均定位于細(xì)胞膜，染色呈棕黃色著色。隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍視野（×40）計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的百分比。＜30%為弱陽(yáng)性，30%～60%為陽(yáng)性，＞60%為強(qiáng)陽(yáng)性，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為（-）。免疫組化結(jié)果由2 位病理科主治醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行觀察判斷，結(jié)果不一致時(shí)共同觀察切片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料均以±s表示，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier 方法作生存分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化SP 法觀察CD133 蛋白在HCC 組織中的表達(dá)

HCC 中CD133 主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒著色（圖1），陽(yáng)性表達(dá)率58.1%（25/43），高于在癌旁正常肝組織中的表達(dá)19.4%（7/36），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。臨床特征分析提示CD133 蛋白的表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度及門(mén)靜脈癌栓形成有關(guān)；臨床分期中Ⅲ+Ⅳ期患者CD133蛋白表達(dá)高于Ⅰ+Ⅱ期患者（P＜0.05），但與患者年齡、性別及甲胎蛋白無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 CD133蛋白在HCC及癌旁組織中的表達(dá)情況

2.2 免疫組化SP 法觀察CD44 蛋白在HCC 組織中的表達(dá)

HCC組織中CD44蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜，呈線性棕黃色著色（圖2），陽(yáng)性表達(dá)率69.8%（30/43），高于癌旁肝組織的22.2%（8/36），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。CD44 蛋白的表達(dá)與臨床分期（Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期）及門(mén)靜脈癌栓形成有關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡及甲胎蛋白含量無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。CD44的表達(dá)與腫瘤分化程度及大小無(wú)明顯關(guān)系，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

圖1 CD133在HCC中的表達(dá)（×200）

圖2 CD44在HCC中的表達(dá)（×200）

表2 CDl33和CD44蛋白表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 生存分析

隨訪時(shí)間3～36 月，平均25 月。隨訪期間腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移28 例，死亡16 例。采用Kaplan-Meier 方法作生存分析比較3年總體生存率。CD133陽(yáng)性表達(dá)組（40%）低于陰性表達(dá)組（72.2%）(P＜0.05），見(jiàn)圖3；CD44蛋白陽(yáng)性表達(dá)組（43.3%）也低于陰性表達(dá)組（76.9%）（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

表3 CD44蛋白在HCC及癌旁組織中的表達(dá)情況

3 討論

HCC是我國(guó)肝癌患者的主要病理類(lèi)型，與HBV感染、肝硬化的序慣性改變有關(guān)。手術(shù)切除為其主要的治療方式，但術(shù)后易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重制約臨床療效的提高[8]。因此尋找肝癌進(jìn)展的基因及治療靶點(diǎn)對(duì)臨床早期診斷及提升治療效果具有重要意義。CSCs是近年該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，與腫瘤的形成及演變發(fā)展密切相關(guān)。

圖3 CD133陽(yáng)性表達(dá)的生存曲線

圖4 CD44陽(yáng)性表達(dá)的生存曲線

CD133 是腫瘤干細(xì)胞特征性標(biāo)志物，定位在人類(lèi)4號(hào)(4p16.12.p1)和2號(hào)染色體上，是一種5次跨膜的細(xì)胞表面糖蛋白，與腫瘤細(xì)胞間存在密切的聯(lián)系[9]。已有的研究提示CD133的表達(dá)與多種惡性腫瘤患者的預(yù)后具有相關(guān)性[10-11]。在肝癌中的研究也表明CD133的表達(dá)與肝癌的分化程度及臨床分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[12]。在本組研究中CD133在HCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)為25 例（58.1%），明顯高于癌旁組織7 例（19.4%），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示CDA133是HCC細(xì)胞較特異的表面標(biāo)志物，并在肝癌的成瘤過(guò)程中發(fā)揮作用。通過(guò)對(duì)臨床病理特征的分析發(fā)現(xiàn)CD133的表達(dá)與患者年齡、性別、甲胎蛋白等無(wú)明顯相關(guān)性；與腫瘤直徑、臨床分期及門(mén)脈癌栓形成的有關(guān)。提示CD133蛋白的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性高有關(guān)，這與CD133 在其他腫瘤中的研究結(jié)果類(lèi)似[13]。進(jìn)一步的生存分析也顯示CD133 陽(yáng)性組的HCC 患者3 年生存率低于陰性，提示CD133 的表達(dá)與HCC患者的生存時(shí)間相關(guān)。

CD44是另一種LCSCs的表面標(biāo)記分子，具有介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢、向炎癥部位侵化及黏附細(xì)胞外基質(zhì)等作用[14]。目前較多的研究表明CD44 基因表達(dá)的上調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移功能的增強(qiáng)，這與CD133在腫瘤組織中的作用具有相似性[15]。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)HCC 和癌旁組織中CD44 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示CD44 蛋白定位于HCC細(xì)胞膜，呈線性棕黃色著色，其陽(yáng)性細(xì)胞呈分散或簇狀分布在肝癌組織中。在43例HCC組織中CD44表達(dá)陽(yáng)性為30 例（69.8%），高于癌旁組織8 例（22.2%），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CD44 是HCC 細(xì)胞較特異的表面標(biāo)志物，并在肝癌的成瘤過(guò)程中發(fā)揮作用。臨床特征分析提示CD44 的陽(yáng)性表達(dá)與HCC 的臨床分期及門(mén)脈癌栓形成有關(guān)。生存分析結(jié)果顯示CD44 陽(yáng)性組患者3 年總體生存率低于陰性組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與CD44 在消化系統(tǒng)的其他腫瘤中的研究結(jié)果類(lèi)似[16]。

4 結(jié)論

表達(dá)CD133 和CD44 蛋白肝癌干細(xì)胞與肝癌的形成及其侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，推測(cè)其可能參在肝癌成瘤、侵襲及轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。通過(guò)檢測(cè)CD133 和CD44 蛋白的表達(dá)可為肝癌生物學(xué)行為提供新的判斷指標(biāo)，但其影響肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。