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不同液體復(fù)蘇方式未改善膿毒癥大鼠心肌線粒體功能

2019-03-21 12:54丁,胡艷,張敏,劉
關(guān)鍵詞:膜電位復(fù)合物乳酸

丁 丁,胡 艷,張 敏,劉 念

(1安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?;A(chǔ)部;2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,安徽合肥 230022)

心肌功能障礙是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥,死亡率高達(dá)40%[1],心肌線粒體是重要的損傷目標(biāo)[2],在膿毒癥中心肌線粒體功能障礙可導(dǎo)致心肌受損,進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭[3]。但是由于導(dǎo)致心肌線粒體功能障礙的機(jī)制復(fù)雜,目前缺乏有效的靶向治療。液體復(fù)蘇廣泛用于膿毒癥患者的早期干預(yù),主要復(fù)蘇液體包括乳酸林格氏液(RL)、生理鹽水(NS)和白蛋白(ALB)。然而,選擇何種液體進(jìn)行液體復(fù)蘇仍存在爭(zhēng)議[4-8]。本文研究了不同復(fù)蘇液進(jìn)行液體復(fù)蘇時(shí)膿毒癥大鼠的心肌損傷的保護(hù)作用和心肌線粒體功能的動(dòng)態(tài)變化,并研究了不同復(fù)蘇液對(duì)心肌線粒體功能的影響。

1 方 法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠

清潔級(jí)雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠180只,體重(213.58±20.74)g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào):SCXK(皖)2015-02。

1.2 膿毒癥大鼠模型的制備及分組

180 只SD 大鼠隨機(jī)分為組(每組12 只)。使用10%水合氯醛(10 mg/kg)通過腹腔注射將實(shí)驗(yàn)大鼠完全麻醉。對(duì)照組只接受開腹和關(guān)腹治療。實(shí)驗(yàn)組用盲腸結(jié)扎法制備膿毒癥大鼠模型,盲腸結(jié)扎法致病菌具有多樣性,包括兼性厭氧菌、革蘭陽性菌、酵母菌、腸厭氧微生物等,與人類膿毒癥致病菌類似,能夠較好的反映膿毒癥的病理生理過程。試驗(yàn)組隨機(jī)分為膿毒癥組(無復(fù)蘇液體)、乳酸林格復(fù)蘇組(RL組)、生理鹽水復(fù)蘇組(NS 組)和白蛋白復(fù)蘇組(ALB組)。使用微型泵通過右股靜脈插管在復(fù)蘇組中制備膿毒癥模型后1 h 開始進(jìn)行液體復(fù)蘇。對(duì)照組和試驗(yàn)組隨后根據(jù)時(shí)間以12 h、24 h 和48 h 為節(jié)點(diǎn)進(jìn)行研究。12 h RL 組、NS 組和ALB 組的大鼠分別接受10 mL/kg/h RL、10 mL/kg/h NS 和3 mL/kg/h ALB(5%),進(jìn)行連續(xù)12 h 液體復(fù)蘇。24 h RL 組、NS 組和ALB 組大鼠在術(shù)后分別接受10 mL/kg/h RL、10 mL/kg/h NS 和3 mL/kg/h ALB,進(jìn)行連續(xù)24 h 液體復(fù)蘇,48 h RL 組、NS 組和ALB 組大鼠在術(shù)后分別接受15 mL/kg/h RL、15 mL/kg/h NS和5 mL/kg/h ALB,進(jìn)行連續(xù)48 h液體復(fù)蘇。

1.3 標(biāo)本收獲

對(duì)照組和試驗(yàn)組大鼠在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)(12、24和48 h)被處死后,從大鼠左心室采集心肌組織。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

一般觀察:三名對(duì)不知道特定分組情況的研究人員觀察所有大鼠的一般狀況,并測(cè)量大鼠的心率和體溫。另一名研究人員負(fù)責(zé)分析數(shù)據(jù)并觀察實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)精神萎靡、全身顫抖、行走不穩(wěn)、腹脹腹瀉等癥狀,為膿毒癥造模成功。心肌被固定在10%多聚甲醛中,脫水,并包埋在石蠟中,切割厚度為5 μm的石蠟切片,放在載玻片上,用蘇木精伊紅(HE)染色以進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。凋亡的心肌細(xì)胞被觀察到是整個(gè)心肌區(qū)域的空泡化區(qū)域。組織病理學(xué)變化按0~4的等級(jí)評(píng)分如下:0=正常;1=最小損壞;2=輕微損壞;3=中度損壞;4=嚴(yán)重?fù)p壞。三名從事組織病理學(xué)工作超過10 年的病理醫(yī)師被要求同時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查并給出相應(yīng)的分?jǐn)?shù),平均值被計(jì)算為最終的病理分?jǐn)?shù)。

心肌線粒體功能的測(cè)量:用4 ℃生理鹽水不間斷沖洗掉心臟各腔室及大血管的血液,用濾紙反復(fù)吸干心臟上的水分后在天枰上稱重。在左心室取約250 mg心肌組織。心肌組織切碎后在4 ℃介質(zhì)(0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl,pH7.4,0~4 ℃)中制備心肌組織勻漿。勻漿經(jīng)750 g、離心10 min后留上清,以9 000 g 離心20 min 后留沉淀,重新懸浮后以9 000 g再離心20 min,棄上清得線粒體,全部操作于4 ℃進(jìn)行。心肌線粒體懸浮液的純度為17~20 mg/mL。用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)量線粒體膜電位,并用FL-1通道的熒光強(qiáng)度/FL-2通道的熒光強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估[9]。激發(fā)波長設(shè)置為488 nm,F(xiàn)L-1 通道的最大發(fā)射波長為580/590 nm,F(xiàn)L-2 通道的最大發(fā)射波長為510/527 nm,并使用Cell Quest 軟件分析圖像。ATP可以分解成ADP 和無機(jī)磷,因此,并用分光光度法測(cè)定無機(jī)磷含量評(píng)價(jià)線粒體Ca2+-Mg2+-ATPase 活性。線粒體呼吸鏈復(fù)合體I 和II 的活性用比色定量法[10]測(cè)量。線粒體呼吸鏈復(fù)合體I 活性隨著氧化后NADH峰值水平的降低而被評(píng)估。線粒體呼吸鏈復(fù)合物II 活性在還原后隨著二氯酚-吲哚酚峰值水平的降低而被評(píng)估。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有的實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中均未死亡。實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后12 h 出現(xiàn)膿毒癥癥狀,例如心率和呼吸頻率加快、體溫升高、精神反應(yīng)不良、食欲不振和體重減輕,超過一半出現(xiàn)出血傾向和腹瀉癥狀。這些結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組成功建立了膿毒癥模型。對(duì)照組大鼠則未出現(xiàn)心率和呼吸頻率沒有加快,體溫上升,精神反應(yīng)不良,食欲不振和體重減輕癥狀。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn),每個(gè)研究分組中復(fù)蘇液的平均量見表1。

表1 不同組復(fù)蘇液的平均量

2.2 心肌組織病理學(xué)觀察

蘇木精伊紅(HE)染色法對(duì)照組心肌纖維條紋清晰,無明顯變性和壞死,心肌間質(zhì)無明顯改變(圖1A)。膿毒癥組和復(fù)蘇組心肌組織發(fā)生炎癥反應(yīng),部分心肌細(xì)胞發(fā)生變性和局灶性壞死,尤其是24和48 h(圖1B、1C和1D)。組織病理學(xué)評(píng)分顯示48 h膿毒癥組>24 h 膿毒癥組>12 h 膿毒癥組>對(duì)照組[(3.19±0.21)vs(2.04±0.17)vs(0.96±0.13)vs(0.11±0.07),均P<0.05]。

圖1 大鼠心肌組織病理切片箭頭所示為心肌細(xì)胞變性和局灶性壞死

2.3 心肌線粒體功能

表2 各組大鼠心肌線粒體膜電位比較(±s)

表2 各組大鼠心肌線粒體膜電位比較(±s)

注:a 與對(duì)照組比較,P<0.01;b 與12 h 膿毒癥組比較,P<0.05

與對(duì)照組相比,膿毒癥大鼠24 h 和48 h 的心肌線粒體膜電位降低(P<0.01),24 h和48 h非復(fù)蘇組的膜電位低于12 h非復(fù)蘇組(P<0.01),48小時(shí)非復(fù)蘇組的膜電位低于24 h 非復(fù)蘇組(P<0.05)(見表2,圖2)。

表3 各組大鼠心肌線粒體Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較(±s)

表3 各組大鼠心肌線粒體Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比較(±s)

注:a 與對(duì)照組比較,P<0.05;b 與12 h 膿毒癥組比較,P<0.05;c 與12 hRL 組比較,P<0.05;d 與12 NS 組比較,P<0.05;e與12 hALB組比較,P<0.05

與對(duì)照組相比,膿毒癥大鼠12 h、24 h和48 h的Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低(P<0.01),24 h 和48 h非復(fù)蘇組的Ca2+-Mg2+-ATPase活性低于12 h非復(fù)蘇組(P<0.05),48 h非復(fù)蘇組的Ca2+-Mg2+-ATPase活性低于12 h和24 h非復(fù)蘇組(P<0.05)(見表3,圖3)。

表4 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性的比較(±s)

表4 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性的比較(±s)

注:a 與對(duì)照組比較,P<0.01;b 與12 h 膿毒癥組比較,P<0.05;c與12 hRL組比較,P<0.05;d與12 h NS組比較,P<0.05;e與12 hALB組比較,P<0.05

與對(duì)照組相比,膿毒癥大鼠在12 h、24 h 和48 h的復(fù)合物I活性降低(P<0.01),24 h和48 h非復(fù)蘇組的復(fù)合I 活性低于12 h 非復(fù)蘇組(P<0.05)(見表4,圖4)。

表5 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物II活性的比較(±s)

表5 各組大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物II活性的比較(±s)

注:各組均無顯著差異

與對(duì)照組相比,膿毒癥大鼠的復(fù)合物II 活性沒有降低(P>0.05)(見表5、圖5)。同一時(shí)間點(diǎn),非復(fù)蘇組和復(fù)蘇組的心肌線粒體膜電位和Ca2+-Mg2+-ATPase、復(fù)合物I 和II 的活性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見圖2~5),這表明用乳酸林格氏液、生理鹽水和白蛋白復(fù)蘇不會(huì)恢復(fù)心肌線粒體膜電位和Ca2+-Mg2+-ATPase和復(fù)合物I和II的活性。

圖2 心肌線粒體膜電位

圖3 Ca2+-Mg2+-ATPase活性(g/L)

圖4 線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性(U/mg)

圖5 線粒體呼吸鏈復(fù)合物II(U/mg)

3 討論

液體復(fù)蘇是膿毒癥“Buddle化”治療的重要組成部分,在臨床工作中有著重要的地位。研究表明,膿毒癥發(fā)生6 h內(nèi)進(jìn)行液體復(fù)蘇治療的效果最好,且在24 h內(nèi)如能進(jìn)行及時(shí)的液體復(fù)蘇可以顯著降低膿毒癥的死亡率。膿毒癥發(fā)生24 h內(nèi)進(jìn)行液體復(fù)蘇可以改善嚴(yán)重膿毒癥患者的微循環(huán),但膿毒癥持續(xù)48 h后再進(jìn)行液體復(fù)蘇不能改善微循環(huán)[9]。因此,在本文中選擇膿毒癥模型建立后的12 h、24 h 和48 h 作為觀察時(shí)間點(diǎn)[10]。

對(duì)膿毒癥患者而言,早期液體復(fù)蘇是關(guān)鍵的干預(yù)措施。在復(fù)蘇液體的選擇上,晶體液具有價(jià)廉、保質(zhì)期長并且能夠較好的達(dá)到復(fù)蘇目的等優(yōu)勢(shì),一般作為復(fù)蘇液體的首選,滲透性和電解質(zhì)組成的不同晶體液會(huì)對(duì)肌體的內(nèi)環(huán)境造成不同影響,相比較而言,因?yàn)樯睇}水本身的“非生理性離子配比”,故而乳酸林格液更有優(yōu)勢(shì)[11]。乳酸林格液作為性質(zhì)上最相似的細(xì)胞外液,廣泛用于液體復(fù)蘇。乳酸有L型和D型兩種異構(gòu)體。D型乳酸會(huì)引起中性粒細(xì)胞(PMN)的活化,這可能導(dǎo)致組織損傷。L型乳酸能降低PMN的活化,因此具有免疫保護(hù)作用。白蛋白作為膠體液的代表性藥物之一,其能夠迅速的恢復(fù)血容量,改善微循環(huán)灌注,但并不能降低膿毒癥患者的病死率,目前的研究認(rèn)為沒有一種液體是最理想的復(fù)蘇液體[12]。

一般認(rèn)為在發(fā)生嚴(yán)重膿毒癥時(shí)心肌細(xì)胞線粒體膜電位會(huì)明顯降低,是由于此時(shí)過氧化物和一氧化氮(NO)等抑制電子傳遞鏈復(fù)合物活性和誘導(dǎo)解耦聯(lián)蛋白的活性增強(qiáng),從而使質(zhì)子泵出減少和加劇線粒體質(zhì)子泄漏,最終使線粒體膜電位下降、ATP生成減少;而線粒體膜電位降低與線粒體膜通透性改變密切相關(guān)。一般認(rèn)為液體復(fù)蘇能夠起到改善微循環(huán)、減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、改善血管通透性等一系列積極的作用,液體復(fù)蘇是膿毒癥和膿毒癥休克的基礎(chǔ)組成部分。我們的結(jié)果證實(shí)了持續(xù)的液體復(fù)蘇能夠維持膿毒癥大鼠的平均動(dòng)脈壓,保證體循環(huán)的穩(wěn)定,但在持續(xù)復(fù)蘇的過程中心肌線粒體功能仍呈現(xiàn)出了時(shí)間依賴性的損害,而且采用不同時(shí)長和復(fù)蘇液進(jìn)行不同方式的液體復(fù)蘇均未沒有起到保護(hù)膿毒癥大鼠心肌線粒體功能、改善膿毒癥大鼠的心肌線粒體功能障礙的目的,提示導(dǎo)致線粒體功能損害的微循環(huán)障礙和平均動(dòng)脈壓所代表的體循環(huán)之間還存在著諸多的差異。

4 結(jié)論

液體復(fù)蘇能夠維持膿毒癥大鼠的平均動(dòng)脈壓,但是通過延長復(fù)蘇時(shí)間和使用包括乳酸林格氏液、生理鹽水和白蛋白在內(nèi)的常用晶體或膠體液進(jìn)行液體復(fù)蘇并不能取得預(yù)期的膿毒癥大鼠心肌保護(hù)作用,膿毒癥大鼠的心肌線粒體功能仍呈現(xiàn)時(shí)間依賴性損害。雖然膿毒癥液體復(fù)蘇在膿毒癥治療中仍然有著重要的價(jià)值,但不具備保護(hù)心肌線粒體功能的作用,因此還需要我們從其他的方面著手進(jìn)行心肌線粒體的保護(hù)工作。

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