苗海生，李 樂，廖德芳，寇美玲，孟錦昕，楊振興，李華春

（云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224）

藍舌病（Bluetongue，BT）是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的藍舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的，主要感染綿羊等反芻動物的一種蟲媒病毒病。BTV廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，2006—2009年，BTV-8型疫情在歐洲部分國家大規(guī)模流行，造成巨大經(jīng)濟損失，而BTV滅活疫苗的使用成為這些國家有效控制BT疫情的重要手段[1-4]。云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室利用純化的全病毒，通過免疫綿羊和兔子，制備了BTV群特異性抗血清，并通過優(yōu)化反應條件，建立了BTV cELISA 抗體檢測方法。前期研究表明，該方法可檢測針對BTV所有抗原表位的抗體。BTV微量血清中和試驗（SNT）是檢測待檢血清中和抗體的方法。該中和抗體針對的是BTV感染動物的主要結(jié)合位點，可用于評價抗體阻斷BTV感染的效果。

本研究利用BTV-1型滅活疫苗免疫30只綿羊，另設6只作為空白對照，定期采集血清，用BTV cELISA和SNT方法同時檢測綿羊血清抗體，比較抗體產(chǎn)生的時間以及抗體的符合性、相關性，分析不同檢測方法的特點和相互關系。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、細胞和毒株

36只成年考摩型細毛綿羊：經(jīng)檢測確定為BTV抗體陰性，購自云南省種羊繁育擴繁中心；BHK-21細胞和BTV-1型毒株：由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

藍舌病cELISA試劑盒：云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室制備；MEM維持液原粉：購自Gibco公司；洗液（PBST）：0.01 mol/L 的PBS溶液中加入0.5%的Tween-20；稀釋液（PBSTM）：0.01 mol/L的PBS溶液中加入0.05%的Tween-20和5%的脫脂奶粉；單組分TMB底物：購自BIO BASIC INC公司。

1.3 cELISA血清抗體檢測

取出試劑盒提供的96孔ELISA板，按每孔10 μL加入待檢血清、陰性對照血清、陽性對照血清、強陽性對照血清；所有孔加入用稀釋液作 1 000倍稀釋的兔抗BTV血清，50 μL/孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應1 h；用PBST洗板1次，加入1 000倍稀釋的HRP標記綿羊抗兔IgG，50 μL/每孔，于37 ℃培養(yǎng)箱中反應30 min；用PBST洗板5次，拍干后按50 μL/孔加TMB顯色劑，室溫避光顯色10 min，然后按50 μL/孔，加1.24 mol/L的硫酸終止反應，最后用ELISA讀板儀在450 nm處讀取結(jié)果。將OD450nm按公式PI=（抗原對照平均OD450nm-樣品OD450nm）/抗原對照平均OD450nm，換算為抑制率（Present inhabitation，PI）。當PI≥40%時，判為BTV抗體陽性；PI＜40%時，判為BTV抗體陰性。

1.4 中和抗體檢測

首先將所有血清放入56 ℃的水浴鍋內(nèi)滅活30 min。在微量細胞培養(yǎng)板（96孔板）所有孔，分別加50 μL MEM細胞維持液；在第1排孔中，加入待檢血清以及陽性和陰性對照血清各50 μL，每個樣品2孔，即第1排孔血清為1/2倍稀釋?；靹蚝?，用移液器從第1排孔內(nèi)吸取50 μL移入第2排孔，則第2排孔內(nèi)血清為1/4倍稀釋，依次照此稀釋，則第8排孔內(nèi)血清為1/256倍稀釋。將準備好的 BTV-1型細胞稀釋成 100×TCID50（50 μL），然 后 每 孔 加 入 50 μL， 并 設 立 100×TCID50、10×TCID50、1×TCID50的病毒對照和空白對照。將細胞培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1 h后，每孔加100 μL BHK-21細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)120 h。當對照正常時，用甲基蘭染色，進行結(jié)果判定。被檢血清孔出現(xiàn)大于50%的細胞病變（CPE）時，判為血清BTV抗體陰性；出現(xiàn)小于等于50%的病變時，判為血清BTV抗體陽性。用Karber法計算血清中和抗體效價。

1.5 綿羊免疫及血清樣品采集

利用BEI滅活劑，滅活BTV-1型病毒懸液，制備滅活疫苗；利用BHK-21細胞對滅活抗原進行安全性檢驗，并用ELISA抗原定量方法進行定量；經(jīng)PEG 6000濃縮后再進行稀釋，制備病毒顆粒含量分別為 1、5、10、50、100 μg/mL的疫苗各100 mL；按順序依次命名為1～5組，另設立免疫PBS乳化液的對照組，每組6只綿羊。首次免疫21 d后進行第2次免疫，各組免疫量同第1次免疫，免疫前和免疫后每周各采集血清1次，直至第5周。將采集的血清樣品分別進行BTV cELISA和SNT 檢測。

1.6 檢測結(jié)果統(tǒng)計分析

匯總檢測結(jié)果，并利用SPSS、EXCEL軟件，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，比較兩種方法檢測到抗體在時間上的差異及規(guī)律，以及兩種檢測方法的線性相關性。

2 結(jié)果與分析

2.1 cELISA檢測結(jié)果統(tǒng)計

BTV cELISA檢測結(jié)果顯示，首次免疫后（綜合第1～3周）1、2組陽性率均為83.33%，其他2個免疫組抗體陽性率均為100%，對照組抗體陽性率為0，對照組正常（表1）。第2次免疫后（綜合第4～5周）各免疫組抗體陽性率均為100%，對照組陽性率為0。各免疫組不同時間（周）的抗體陽性羊數(shù)量和抗體陽性率統(tǒng)計見表2。由表2可知，免疫后第1周，抗體陽性率達到80.00%，抗體陽性綿羊數(shù)量隨時間延長而增加，到第4周（第2次免疫后2周）全部免疫羊轉(zhuǎn)為BTV抗體陽性。值得注意的是，第5組抗體陽性率在首次免疫后明顯低于其他組，而它所用的抗原含量卻是最高的，這可能與免疫抑制有關。

表1 BTV cELISA檢測結(jié)果統(tǒng)計（按免疫次數(shù)）

2.2 SNT檢測結(jié)果統(tǒng)計

利用SNT方法對所有血清進行中和抗體檢測，檢測結(jié)果見表3，統(tǒng)計結(jié)果見表4。由表3、表4可知，SNT抗體陽性率（抗體效價≥16判為陽性）在首次免疫后3周內(nèi)持續(xù)上升，由第1周的6.67%上升至第3周的36.67%，上升幅度高于cELISA抗體。至第3周，46.66%的羊產(chǎn)生了較高的cELISA抗體，而SNT抗體卻仍為陰性。第2次免疫后，全部免疫動物的SNT抗體陽性率最高才達到70.00%。由此可見，BTV SNT抗體產(chǎn)生的特點是持續(xù)而緩慢。

表2 BTV cELISA檢測結(jié)果統(tǒng)計（按免疫時間）

2.3 cELISA抗體與中和抗體產(chǎn)生時間比較

利用EXCEL對cELISA和SNT檢測結(jié)果進行分析。由圖1可知，免疫后1周，cELISA抗體陽性率為80.00%，抗體產(chǎn)生速度較快，而SNT抗體陽性率僅為6.67%；免疫后5周，cELISA抗體陽性率為100%，SNT抗體陽性率為70.00%；SNT抗體陽性率持續(xù)緩慢上升，至第4周（即第2次免疫后1周）抗體水平才出現(xiàn)大幅度上升。

圖1 免疫后0～5周的cELISA和SNT抗體陽性率比較

表3 BTV SNT抗體效價檢測結(jié)果

表4 BTV SNT抗體效價檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.4 cELISA抗體和中和抗體符合率隨時間變化趨勢

由于綿羊產(chǎn)生cELISA抗體快，而產(chǎn)生中和抗體慢，使得很多動物出現(xiàn)cELISA抗體陽性時，中和抗體卻仍為陰性，從而產(chǎn)生了cELISA抗體和中和抗體不符合現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在免疫初期較多，但是隨著中和抗體陽性率的上升逐漸減少（表5），兩種檢測方法的符合率由23.33%增加到76.67%。

表5 cELISA抗體和SNT抗體檢測結(jié)果符合率變化統(tǒng)計

2.5 cELISA抗體PI值和中和抗體效價相關性

利用SPSS軟件對cELISA PI值和中和抗體效價（log2）檢測結(jié)果進行線性相關性分析，發(fā)現(xiàn)當綿羊同時產(chǎn)生中和抗體和cELISA抗體時，二者有顯著的相關關系（r=0.63），相關方程為y=0.38+0.05χ，式中y為抑制率，χ為SNT 效價（log2），見圖2。

圖2 cELISA抗體PI值和SNT抗體效價線性相關關系

3 討論

本研究使用的BTV cELISA抗體檢測方法為云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室自行制備的檢測方法。該檢測方法中與待檢血清競爭反應的檢測抗體是通過完整病毒顆粒免疫動物獲得的多克隆抗體，因此它針對的是BTV所有的抗原表位。中和試驗主要針對的是BTV VP7蛋白。VP7蛋白約有349個氨基酸，位于病毒核衣殼表面，呈三聚體結(jié)構，其中第134～253位氨基酸所構成的晶體結(jié)構位于VP7蛋白三聚體結(jié)構外表，是決定VP7蛋白抗原性的主要部位，也是與宿主細胞識別并吸附的主要部位[5-6]。Wang等[7]的免疫電鏡法分析結(jié)果表明，完整病毒粒子和核心顆粒中至少有6個抗原表位，而且免疫動物能夠識別所有這6個抗原表位，其中有2個表位（VP2、VP5）暴露于病毒表面，其余包含在內(nèi)部。本研究發(fā)現(xiàn)，BTV-1型滅活疫苗中與病毒感染相關抗原表位對應抗體的產(chǎn)生時間晚于病毒的其他抗原表位，這也許與VP7蛋白主要抗原表位位于病毒衣殼的中間層，致使該蛋白刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體延遲有關。

BTV非常穩(wěn)定，在4 ℃條件下可穩(wěn)定存在6個月以上。這主要是因為BTV衣殼蛋白對溫度、pH的抵抗力較強，不容易降解。本研究中，cELISA采用多克隆檢測抗體，先期檢測到的可能是衣殼外層的VP2和VP5蛋白抗體，故從接種到檢測到抗體的時間短，只有待病毒顆粒外層衣殼被降解后，暴露出位于衣殼中間層的VP7蛋白，才會產(chǎn)生針對該蛋白的抗體。兩種檢測方法的線性相關性表明，一旦該蛋白發(fā)揮了免疫原性功能，并且在免疫動物間產(chǎn)生的抗體效價與其他蛋白抗體量線性關系顯著，就進一步證實了VP7蛋白在發(fā)揮免疫原特性方面與其他蛋白具有同等功能。但部分動物產(chǎn)生了很高的cELISA抗體，卻沒有產(chǎn)生SNT抗體，其原因僅為推測。要完全證實此推測，并且解決病毒在侵染動物細胞時，是否還有其他蛋白發(fā)揮影響以及此影響產(chǎn)生的方式等，還需進一步開展相關研究。