蔣文明，李 陽，程善菊，劉華雷

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，國家禽流感專業(yè)實驗室，山東青島 266032）

1996年，我國首次從廣東省鵝體內分離到H5N1亞型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）[1]。從2003年末開始，H5N1亞型禽流感疫情在東南亞多個國家的家禽中暴發(fā)，包括越南、泰國、韓國、日本、柬埔寨和印度尼西亞。2004—2015年，我國多個省份暴發(fā)H5N1亞型高致病性禽流感疫情，導致超過2 000萬只禽類被撲殺，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經濟損失。2005年底，我國針對H5亞型AIV開始實行大規(guī)模強制免疫政策，并有效控制了疫情。實踐證明，在禽流感防控方面，疫苗免疫發(fā)揮了巨大作用[2]。但是不可否認，疫苗免疫也帶來了一系列問題，如加快了病毒變異速度，使得疫苗必須進行相應更新換代[3]。我國使用的禽流感疫苗從最初的N28、Re-1到Re-4、Re-5，再到Re-6、Re-8，到最新的Re-11、Re-12一直在不斷更新。病毒變異是由于其血凝素（Hemagglutinin，HA）基因中核苷酸變異引起的。而核苷酸的加速變異會導致以HA基因為靶基因檢測方法特異性、敏感性的下降，出現假陰性結果。

現行檢測方法中，行業(yè)標準《禽流感病毒RTPCR檢測方法》（NY/T 772—2013）采用的是普通RT-PCR方法。該方法檢測耗時長，需電泳后判定結果，容易造成環(huán)境核酸污染。國家標準《H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》（GB/T 19438.2—2004）因制定時間太久，可能已不能滿足臨床病毒變異檢測需求。本研究比對了近年來分離到的H5亞型HPAIV HA基因核苷酸序列，在其保守區(qū)設計1對引物和1條探針，建立了H5亞型HPAIV實時熒光RT-PCR方法，并進一步驗證了該方法的特異性和敏感性，同時與臨床上常使用的兩種試劑盒進行對比，以期為該病的快速檢測、診斷提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒

30株 H5亞 型 HPAIV（5株 H5N1、5株H5N2、15株H5N6、5株H5N8），H7N9、H9N2等亞型AIV，以及新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒：均由本實驗室分離保存。

1.2 試劑盒

QIAamp Viral RNA Mini Kit：購自 Qiagen 公司；HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit：購自Vazyme公司；TOPO載體克隆試劑盒：購自CloneSmarter公司；禽流感（AIV-H5）核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒：購自深圳匹基生物工程股份有限公司（批號20180302）；禽流感病毒H5亞型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒：購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司（批號AIVH5 20180702P）。

1.3 引物設計

根據近年來GenBank數據庫中公布的H5亞型AIV基因序列以及本室分離的H5亞型AIV序列，針對HA基因序列保守區(qū)，設計1對引物及1條探針（專利申請中，序列待公開）。探針5'端標記FAM，3'端標記BHQ1。

1.4 實時熒光RT-PCR方法建立

根據QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說明，提取H5亞型病毒RNA。在反應體系中依此加入2×qRT-PCR Buffer 10.0 μL，引物、探針各 1.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 1.0 μL，最后加入RNA模板 6 μL。RT-PCR反應條件為：50 ℃10 min，95 ℃ 2 min，然后進行40個循環(huán)（95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，收集熒光信號）。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，經膠回收后連接TOPO載體，然后進行測序。

1.5 實時熒光RT-PCR方法優(yōu)化

對反應體系中的不同引物和探針濃度組合（ 引 物 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μmol/L， 探 針1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μmol/L）以及反應體積（50、20 μL）和擴增時反應參數（反轉錄5、10、15 min，退火延伸20、30 s）等條件進行摸索和優(yōu)化，以達到最優(yōu)組合。

1.6 敏感性試驗

提取病毒RNA，用微量核酸分析儀測定病毒RNA含量。將RNA作10倍倍比稀釋，取6.0 μL稀釋后的RNA模板，加入到14.0 μL qRT-PCR預混液中，然后采用建立的熒光定量RT-PCR方法進行檢測，確定其靈敏度。

1.7 特異性試驗

利用優(yōu)化的實時熒光RT-PCR方法，分別檢測H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H7N9、H9N2， 以及新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒等常見禽類病毒，檢驗該方法的特異性。

1.8 與臨床同類試劑盒比較

以10倍倍比稀釋的RNA為模板，對比本研究建立的方法與H5亞型AIV核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）、H5亞型AIV實時熒光RT-PCR檢測試劑盒（北京世紀元亨動物防疫技術有限公司）的敏感性。以實驗室分離測序確定的H5病毒RNA為模板，對比該方法與兩種試劑盒的特異性。

1.9 臨床應用

利用建立的實時熒光RT-PCR方法，對臨床發(fā)病家禽的10份組織病料進行檢測，檢驗該方法的準確性。

2 結果

2.1 實時熒光RT-PCR方法的建立及優(yōu)化

為驗證實時熒光RT-PCR引物探針的設計，選取實驗室保存的H5N6亞型AIV進行熒光RTPCR檢測，結果在實時熒光RT-PCR方法中，H5引物探針能夠有效檢出H5N6亞型AIV，檢測結果見圖1。

圖1 H5亞型AIV實時熒光RT-PCR引物探針驗證結果

為進一步說明反應的特異性和準確性，將熒光RT-PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳和測序驗證，結果在約120 bp處看到1條特異性擴增條帶（圖2）；將擴增產物膠回收后連接TOPO載體測序，證實該擴增產物為H5亞型HA基因序列，表明本研究設計的H5亞型引物特異性強，熒光RT-PCR方法特異、準確。

圖2 H5亞型AIV實時熒光RT-PCR擴增產物凝膠電泳結果

在實時熒光RT-PCR體系中，通過對反應體系中不同引物和探針濃度組合、反應體積、擴增時反應參數和循環(huán)次數等條件的摸索和優(yōu)化，建立了檢測H5亞型AIV的實時熒光RT-PCR方法，經過反復優(yōu)化和驗證，確定實時熒光RTPCR檢測方法的最適反應總體積為50 μL（其中模板6 μL），最適引物濃度均為0.4 μmol/L，探針濃度均為0.3 μmol/L。實時熒光RT-PCR最佳反應條件和循環(huán)參數為：第1階段，反轉錄50 ℃ 10 min；第2階段，預變性95 ℃ 2 min；第3 階段，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。在第3階段每次循環(huán)的退火延伸時，收集熒光。試驗結束后，根據收集的熒光曲線和Ct值判定結果。

2.2 實時熒光RT-PCR方法的特異性

利用建立的實時RT-PCR方法，分別對H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H7N9、H9N2 等亞型AIV，以及新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒進行檢測，發(fā)現該方法只能擴增H5亞型AIV，對其他亞型AIV及其他禽病病毒擴增均為陰性（圖3），表明該方法具有良好的特異性。

2.3 實時熒光RT-PCR方法的敏感性

先測定病毒RNA濃度，然后將提取的RNA依次作10倍比稀釋，每個稀釋度取6 μL作為模板進行檢測。結果顯示，該方法可以檢測到0.1 fg（10-6稀釋）的RNA模板（圖4）。

圖3 實時熒光RT-PCR方法的特異性試驗結果

圖4 實時熒光RT-PCR方法的敏感性試驗結果

2.4 與其他試劑盒的對比

以實驗室分離測序確定的30份H5病毒RNA為模板，對比該方法與兩種試劑盒的特異性。結果顯示，本研究建立的方法可以將30份H5病毒全部檢出，檢出率為100%。H5亞型AIV核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）和H5亞型AIV實時熒光RT-PCR檢測試劑盒（北京世紀元亨動物防疫技術有限公司）各有1份檢測為陰性，檢出率均為98%。

將1.6中的RNA依次作10倍倍比稀釋，每個稀釋度取6 μL為模板，分別用兩種商品化H5亞型AIV熒光RT-PCR試劑盒與本研究建立的方法進行比較。結果顯示，本研究建立方法的靈敏度均比這兩種試劑盒提高了10倍（圖5），說明該方法具有良好的敏感性。

圖5 兩種商品化H5亞型AIV熒光RT-PCR方法敏感性結果

2.5 臨床樣品檢測

利用建立的實時熒光RT-PCR方法，對臨床發(fā)病家禽的10份組織病料進行檢測，發(fā)現有6份陽性。該方法與病毒分離結果相比，符合率為100%（圖6），說明該方法具有良好的準確性。

圖6 該方法對臨床組織樣品的檢測結果

3 討論

隨著病毒進化，H5亞型AIV一直在不斷變異。我國現在的流行毒株與1996年最初分離的病毒A/goose/Guangdong/1/1996（H5N1）HA核苷酸同源性僅 為 90.6%（Re-11）和91.2%（Re-12）。以Re-11和Re-12疫苗株為代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支HA核苷酸同源性僅為88.5%。HA核苷酸的快速變異增加了以核苷酸為靶基因檢測方法的難度。

本研究建立和優(yōu)化了H5亞型AIV實時熒光RT-PCR方法，可以檢測出目前常見的H5亞型AIV（包括 H5N1、H5N2、H5N6、H5N8），與其他亞型AIV和其他禽類病原核酸均無交叉反應。該方法的檢出率和檢測下限均優(yōu)于商品化H5 AIV核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）和H5 AIV實時熒光RTPCR檢測試劑盒（北京世紀元亨動物防疫技術有限公司）。

4 結論

本研究建立的H5亞型AIV實時熒光RT-PCR檢測方法具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，可用于H5亞型高致病性禽流感的流行病學調查、監(jiān)測和早期診斷。