謝佳芮，苗海生，寇美玲，李華春

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224）

阿卡斑?。ˋkabane disease）是由阿卡斑病毒（Akabanne disease virus，AKAV）引起的一種牛、綿羊、山羊胎兒先天性疾病。臨床上，山羊以妊娠母羊的流行性流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、畸形胎以及新生胎兒關(guān)節(jié)彎曲為特征。目前本病主要流行于亞洲、大洋洲、南美洲、非洲[1-5]。2012年以來，我國從10多個(gè)省市送檢的1 000多份牛羊血清樣品中也檢出了AKAV抗體，揭示我國也存在該病[6-7]，應(yīng)引起重視。帶毒動(dòng)物是本病的主要傳染源，吸血昆蟲是其傳播媒介。伊蚊、三帶庫蚊、催命按蚊、庫蠓在本病傳播中起著重要作用[8]。帶毒蟲媒可借助風(fēng)力到達(dá)不同地區(qū)，從而引起該病傳播。一般動(dòng)物在感染后1～6 d體溫升高，發(fā)生病毒血癥。在此期間，蚊蠓吸吮血液后，病毒能在蚊蠓體內(nèi)增殖，當(dāng)再叮咬動(dòng)物時(shí)，即發(fā)生傳染。垂直傳播也是該病重要的傳播方式，病毒可經(jīng)胎盤感染胎兒。本病主要侵害反芻動(dòng)物，其中牛、綿羊、山羊最易感。本病具有明顯的季節(jié)性和地區(qū)性，主要發(fā)生于濕熱、吸血昆蟲活躍的夏秋季節(jié)，主要流行于蚊蠓滋生的熱帶、溫帶地區(qū)，特別是池塘、河流較多的低洼地區(qū)，多呈地方性流行或散發(fā)[9]。

云南省位于我國西南邊陲，地理位置特殊，與周邊國家乃至東南亞、南亞的其他國家和地區(qū)交往頻繁，是溝通東南亞、南亞地區(qū)的主要陸上通道。由于一些東南亞國家的動(dòng)物疫病防控意識(shí)薄弱，防控水平較低，再加上這些國家特殊的氣候條件和地理環(huán)境，導(dǎo)致一些動(dòng)物疫情不斷發(fā)生，動(dòng)物帶毒情況較為普遍，尤其是由蚊蟲等吸血昆蟲傳播的蟲媒病毒。近年來，由于飲食習(xí)慣的改變，導(dǎo)致我國牛肉消費(fèi)連年增長，以至于每年有大量牛通過口岸或邊境線進(jìn)入我國境內(nèi)，因此云南省邊境地區(qū)的蟲媒病防控形勢嚴(yán)峻。

目前我國的AKAV分布情況不清，對其危害程度了解仍不全面，這給該病防控帶來了一定難度，亟需開展相關(guān)研究。為掌握云南省邊境地區(qū)的牛AKAV感染情況，應(yīng)用cELISA檢測試劑盒，對2017—2018年采集自云南省12個(gè)邊境縣市的共1 860份牛血清進(jìn)行AKAV抗體檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，評估當(dāng)?shù)谹KAV感染狀況和傳入風(fēng)險(xiǎn)，從而為相關(guān)防控政策研究與制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例定義

1.1.1 AKAV抗體陽性個(gè)體 經(jīng)cELISA 抗體試劑盒檢測為AKAV抗體陽性的牛。

1.1.2 AKAV抗體陽性場 經(jīng)檢測，場內(nèi)有 1 頭或 1 頭以上AKAV抗體陽性個(gè)體的牛場。

1.1.3 AKAV抗體陰性場 經(jīng)檢測，場內(nèi)未檢測到AKAV抗體陽性個(gè)體的牛場。

1.2 樣本來源及抽樣原則

牛血清樣品隨機(jī)采自云南省景洪、勐臘、勐海、孟連、滄源、鎮(zhèn)康、耿馬、芒市、瑞麗、富寧、盈江、隴川12個(gè)邊境縣的134個(gè)散養(yǎng)戶、43個(gè)養(yǎng)殖場、34個(gè)屠宰場、40個(gè)交易市場。

按照預(yù)期流行率進(jìn)行抽樣。根據(jù)文獻(xiàn)及專家建議，對存欄量大于10頭的牛場（戶），按照估計(jì)流行率方法采樣：95%置信水平、10%預(yù)期流行率、5%可接受誤差；對于存欄少于10頭的牛場（戶），全群采樣。

共采集牛血清樣品1 860份，其中2017年1 260份、2018年600份。由當(dāng)?shù)乜h級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)樣本采集，登記各區(qū)縣樣本數(shù)量以及樣本來源、采樣情況。各縣樣品采集數(shù)量見表1。

1.3 檢測方法

采用云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院自行研制的AKAV cELISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測。取出試劑盒提供的96孔ELISA板，在每個(gè)孔中加12 μL待檢血清和陰性、陽性對照樣品，用試劑盒提供的稀釋液按1:100稀釋豚鼠競爭抗體，在稀釋板上按每孔50 μL加入稀釋好的競爭抗體，震蕩混勻；37 ℃溫育1 h，用 PBST 洗液洗板3次，拍干；用稀釋液按 1:1 000稀釋兔抗豚鼠酶標(biāo)二抗，每孔50 μL，37 ℃溫育30 min，用 PBST洗液洗板5次，拍干；每孔加50 μL底物反應(yīng)液，37 ℃避光溫育10～15 min，然后每孔再加50 μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下讀取結(jié)果。當(dāng)陽性對照孔平均 OD ≥ 0.8，陰性對照孔OD ≤0.3時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立，否則不成立。根據(jù)公式計(jì)算抑制率：抑制率=（1-樣品OD/陰性血清OD平均數(shù)）×100%。當(dāng)抑制率≥ 40%時(shí)，判為陽性；當(dāng)抑制率＜ 40%時(shí)，判為陰性。

表1 各地區(qū)樣品采集數(shù)量 單位：份/個(gè)

1.4 檢測結(jié)果分析

采用 IBM SPSS Statistics 22 軟件，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)間顯著性分析，用 Excel 2007 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。根據(jù)樣品背景記錄，按照采樣地區(qū)、采樣畜種、采樣來源以及采樣場點(diǎn)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體情況

本次檢測共在1 860份血清樣品中，檢出抗體陽性108份，個(gè)體陽性率為5.8%（108/1 860），其中2017年為4.9%，2018年為6.3%。

2.2 地域分布

檢測結(jié)果顯示，AKAV在云南邊境地區(qū)存在明顯的地域分布差異。除瑞麗未檢出陽性樣品外，其他縣（市、區(qū)）均檢出抗體陽性，平均抗體陽性率在 0～24.4%之間，且地區(qū)間差異極顯著（P＜0.01），如抗體陽性率最高的為富寧，平均陽性率為22.9%，而隴川、勐海、盈江、瑞麗2017年未檢出抗體陽性，瑞麗、耿馬2018年未檢出抗體陽性（表2）。

表2 2017—2018年牛AKAV血清抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 來源分布

按照不同來源進(jìn)行檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)境內(nèi)牛AKAV抗體陽性率為3.0%，入境牛為6.5%（表3）。利用SSPS軟件進(jìn)行兩組陽性率數(shù)據(jù)無重復(fù)雙因素方差分析，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)差異極顯著（P＜0.01），入境牛的感染率顯著高于境內(nèi)牛。

2.4 品種分布

不同牛品種的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示，黃牛的AKAV抗體陽性率為6.4%，水牛為4.8%。利用SSPS軟件進(jìn)行兩組陽性率數(shù)據(jù)無重復(fù)雙因素方差分析，發(fā)現(xiàn)黃牛感染率顯著高于水 牛（P＜0.05）。

表3 境內(nèi)牛和境外牛AKAV抗體統(tǒng)計(jì)

2.5 場點(diǎn)類型分布

對1 860份血清樣品的檢測結(jié)果，按照交易市場、屠宰場，以及養(yǎng)殖場和村寨散養(yǎng)戶進(jìn)行歸類統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5）顯示，來自交易市場和屠宰場以及養(yǎng)殖場的牛AKAV抗體平均陽性率在7.0%以上，而村寨散養(yǎng)戶的牛AKAV抗體陽性率為2.5%。利用SSPS軟件進(jìn)行兩組陽性率數(shù)據(jù)無重復(fù)雙因素方差分析，發(fā)現(xiàn)交易市場、屠宰場、養(yǎng)殖場的牛AKAV感染率極顯著高于村寨散養(yǎng)戶（P＜0.01）。

3 討論

這12個(gè)邊境縣都屬于熱帶、亞熱帶氣候，年均氣溫均在18 ℃以上，有豐富的降水，水域面積大、植被豐富，森林覆蓋率高，水稻種植密度非常高。這些條件十分有利于吸血昆蟲包括蚊子和叮咬蚊的生長[10-11]，同時(shí)這些縣均采用圈養(yǎng)和放牧相結(jié)合的飼養(yǎng)方法，因而顯著增加了媒介昆蟲將病毒傳播給牛的可能性。

表4 2017—2018兩年不同品種牛的AKAV抗體統(tǒng)計(jì)

富寧縣的牛AKAV抗體陽性率要比其他地區(qū)高很多，這可能是因?yàn)樵摽h不僅氣溫偏高，降水量豐富，而且商品牛陸上交易路線復(fù)雜。富寧縣地處“兩國三省十縣”結(jié)合部，既與越南接壤，國境線長75 km，有大小通道 21 條，又與廣西交界，交界線長超過 400 km，通道更多。因此該地區(qū)與境外以及其他省份的牛貿(mào)易往來十分頻繁。此外，隨著“廣昆高速公路”的全線通車，部分商販將動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品通過高速公路直接入境或出境，逃避檢疫監(jiān)督[12]，因而更增加了動(dòng)物及產(chǎn)品檢疫監(jiān)督工作的難度。陽性率同樣較高的景洪市地理環(huán)境也很特殊，且與緬甸緊緊相連，通道較多，人員往來和邊境貿(mào)易也很頻繁。目前云南邊境地區(qū)的外來動(dòng)物以牛為主，均來自印度、孟加拉、泰國、老撾、緬甸等國，主要通過景洪市邊境村的20余條民間通道進(jìn)入國內(nèi)[13]。

表5 不同采樣地點(diǎn)的牛AKAV抗體統(tǒng)計(jì)

黃牛的AKAV抗體陽性率略高于水牛。這可能是因?yàn)樵颇线吘车貐^(qū)的黃牛主要來自印度和孟加拉國，經(jīng)緬甸進(jìn)入我國[14]。交易市場、屠宰場、養(yǎng)殖場的牛AKAV感染率顯著高于村寨散養(yǎng)戶。這可能是因?yàn)橥涝讏?、交易市場、養(yǎng)殖場的牛來自境內(nèi)和境外的不同地區(qū)，這樣來自不同地理位置的牛在這些場所匯聚，導(dǎo)致感染動(dòng)物與非感染動(dòng)物接觸機(jī)會(huì)增多，因而增大了疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)[15-17]。

AKAV可通過媒介昆蟲傳播，其流行規(guī)律在一定程度上取決于蟲媒昆蟲的活動(dòng)情況[18]。我國一些省市的家畜血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，AKAV在國內(nèi)已有流行，且毒株來自于境外[6-7]，因此我國防堵境外AKAV流行毒株的任務(wù)越來越重要。但我國對AKAV等動(dòng)物蟲媒病毒的研究相對滯后，對AKAV分布和流行情況缺乏系統(tǒng)研究，這給AKAV防控帶來較大困難。

為了提高檢測敏感性，本研究將病例定義為檢測出1份陽性樣品的場即為陽性場。因?yàn)楸狙芯磕康氖橇私庠颇线吘车貐^(qū)牛AKAV血清學(xué)陽性率，所以只要檢出陽性樣品，就將該場認(rèn)定為陽性場。本研究是在 2017—2018年的6—10月進(jìn)行的，當(dāng)時(shí)這些地區(qū)還未開展AKAV疫苗免疫，因此檢測出抗體陽性即視為存在病毒感染。本研究將邊境地區(qū)有一定規(guī)模（≥10頭）的牛場（戶）作為研究目標(biāo)群，經(jīng)抽樣檢測發(fā)現(xiàn)，場群流行率為31.1%，說明病毒污染面較廣。本研究采樣點(diǎn)位于云南省邊境地區(qū)。這些地區(qū)均屬熱帶、亞熱帶地區(qū)，年平均氣溫在18 ℃以上，年降雨量在1 000 mm以上。這種高熱高濕的氣候條件適于庫蠓、蚊蟲的生長和繁殖，易于AKAV傳播[19]。據(jù)有關(guān)資料[20]記載，在云南省僅吸血庫蠓就有 34 種。

邊境各縣是云南省牛的主要產(chǎn)地。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人民生活水平提高、肉食品種增多，國內(nèi)對牛、羊肉的需求量大幅提升，牛羊供不應(yīng)求，導(dǎo)致價(jià)格快速上漲。在價(jià)格利益的驅(qū)動(dòng)下，每年有大量偶蹄動(dòng)物非法入境，海關(guān)部門雖然加大了監(jiān)管力度，但因邊境線長，山水相聯(lián)，無天然屏障，流通渠道多，導(dǎo)致AKAV向我國內(nèi)地?cái)U(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)加大。

為保護(hù)我國畜牧業(yè)健康發(fā)展，對于AKAV抗體陽性率高的地區(qū)，建議繼續(xù)加強(qiáng)養(yǎng)殖場、屠宰場、牲畜交易市場管理，同時(shí)加大對牛群免疫和檢疫工作的監(jiān)督管理，降低飼養(yǎng)密度，隔離病畜，加強(qiáng)生物安全，適時(shí)進(jìn)行疫苗免疫接種，提高AKAV的免疫密度和抗體水平；嚴(yán)控邊境地區(qū)易感動(dòng)物的無序流動(dòng)，降低境外AKAV對國內(nèi)家畜的威脅。對于AKAV抗體陽性率低的地區(qū)，也應(yīng)采取生物安全措施，隔離、淘汰病畜，加強(qiáng)監(jiān)測。在引種/引進(jìn)精液前，需要進(jìn)行AKAV抗體/抗原檢測，不從高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)牛場調(diào)入牛只。另外，夏、秋是AKAV高發(fā)季節(jié)，可以要求養(yǎng)殖場、屠宰場、交易市場以及散養(yǎng)戶采取滅蚊措施，減少叮咬蚊蟲數(shù)量。同時(shí)應(yīng)進(jìn)一步規(guī)范牛羊定點(diǎn)屠宰監(jiān)管，大力推進(jìn)活畜集中屠宰和冷鮮冷鏈上市，嚴(yán)格活畜調(diào)運(yùn)監(jiān)管。加強(qiáng)AKAV防控知識(shí)的宣傳教育，加強(qiáng)蚊蟲AKAV攜帶情況以及畜間感染監(jiān)測，進(jìn)一步掌握該病毒的分布特點(diǎn)和臨床特征并確定傳播媒介蚊種，為本病防治提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過隨機(jī)抽樣方法，在云南邊境12縣（市、區(qū)），抽取134個(gè) 散養(yǎng)戶、43個(gè)養(yǎng)殖場、34個(gè)屠宰場、40個(gè)交易市場進(jìn)行AKAV血清學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)邊境地區(qū)普遍存在AKAV感染；就采樣地區(qū)、采樣場點(diǎn)、采樣牛品種，以及牛來源進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的AKAV抗體陽性率高低不一，且感染區(qū)域有擴(kuò)大趨勢，入境牛感染率顯著高于境內(nèi)牛，交易市場、屠宰場、養(yǎng)殖場的牛AKAV感染率顯著高于村寨散養(yǎng)戶。分析認(rèn)為，血清抗體陽性率的高低主要受入境動(dòng)物影響，因此建議加強(qiáng)邊境地區(qū)牛貿(mào)易的檢疫監(jiān)管，加大AKAV監(jiān)測力度，進(jìn)一步掌握AKAV的流行狀況及其流行特點(diǎn)，保障我國畜牧業(yè)健康發(fā)展。