韓佃剛，葉玲玲，祝 賀，臺(tái)曉媛，孫洪正，周曉黎，尹尚蓮，艾 軍

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；2. 昆明海關(guān)，云南昆明 650200；3. 石林彝族自治縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)站，云南石林 652200；4. 昆明市疾病預(yù)防控制中心，云南昆明 650228）

藍(lán)舌?。˙luetongue，BT）是由藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起反芻動(dòng)物的一種非接觸性蟲(chóng)媒傳播疫病。BTV 屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae），是一種主要由庫(kù)蠓傳播的環(huán)狀病毒。綿羊是本病的主要易感動(dòng)物，山羊、牛、羚羊、駱駝及野生反芻類動(dòng)物均對(duì)本病易感。反芻類動(dòng)物感染BTV的病死率平均為30%，其中綿羊高達(dá)80%；牛和山羊常為隱性感染，偶有發(fā)病和死亡。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將BT列為法定通報(bào)多種動(dòng)物共患疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。目前未有人感染BTV的報(bào)道[1]。BT 1933年首次發(fā)現(xiàn)于牛[2]，目前分布廣泛于全球，美國(guó)、澳大利亞、法國(guó)、英國(guó)、西班牙、韓國(guó)等國(guó)家均有關(guān)于該病的報(bào)道。我國(guó)于1979年在云南省師宗縣首次發(fā)現(xiàn)BT。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)已有 31個(gè)省（自治區(qū)、直轄市）發(fā)現(xiàn)BTV 抗體陽(yáng)性家畜，并從云南、湖北和安徽等地自然感染羊體內(nèi)分離獲得BTV[3]。BT嚴(yán)重?fù)p害畜產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易，是活牛、活羊貿(mào)易的重大阻礙，也是進(jìn)行其他活畜、牲畜胚胎和精子貿(mào)易的障礙之一，引起全球各國(guó)高度關(guān)注。隨著我國(guó)從國(guó)外進(jìn)口種用反芻動(dòng)物種類和數(shù)量的增加，BT經(jīng)口岸傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)加大，因此需要對(duì)進(jìn)境動(dòng)物嚴(yán)格實(shí)施檢疫監(jiān)管，防止該病傳入我國(guó)[4]。OIE推薦的BTV血清學(xué)檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、病毒中和試驗(yàn)（VNT）。競(jìng)爭(zhēng)ELISA（C-ELISA）和阻斷ELISA（b-ELISA）是基于一種結(jié)合到BTV VP7核心蛋白氨基末端的特異性單克隆抗體而開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法，在檢測(cè)中不會(huì)與其他蟲(chóng)媒病病毒抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)[5]。經(jīng)多個(gè)國(guó)際實(shí)驗(yàn)室的比較研究，ELISA檢測(cè)程序目前已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，是檢測(cè)BTV抗體的一種常用方法[6]，可用于多種動(dòng)物血清抗體檢測(cè)，其特異性和敏感性高，成本低，已被廣泛用于臨床BT的診斷檢測(cè)[7-8]。

目前商品化的BTV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒主要由美國(guó)、法國(guó)、西班牙等國(guó)家生產(chǎn)。進(jìn)口試劑盒價(jià)格較高，訂貨周期長(zhǎng)，不能有效滿足基層動(dòng)物檢疫機(jī)構(gòu)開(kāi)展大規(guī)模篩查需求，因而開(kāi)發(fā)性價(jià)比高的國(guó)產(chǎn)試劑盒勢(shì)在必行。本試驗(yàn)用的ELISA檢測(cè)試劑盒由昆明、深圳海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心和云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院等單位共同研制和轉(zhuǎn)化。昆明海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心根據(jù)進(jìn)出境動(dòng)物檢疫需求，于20世紀(jì)80年代研制出BTV瓊擴(kuò)抗體檢測(cè)試劑，并于2009年研制出BTV B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒[9]，2018年對(duì)該試劑盒生產(chǎn)工藝進(jìn)行了改進(jìn)（完成了ELISA試劑盒的抗原預(yù)包被和辣根過(guò)氧化物酶與單抗偶聯(lián)的工藝改進(jìn)），研制的新型BTV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)時(shí)間由原來(lái)的4.5 h縮短至2.5 h。為進(jìn)一步評(píng)估新型BTV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臨床樣品的適用性，將自主研發(fā)的B-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（YN BTV B-ELISA）與法國(guó)ID.VET公司研制的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（ID.VET C-ELISA）進(jìn)行比較試驗(yàn)，以期為臨床檢測(cè)提供性價(jià)比高、使用方便、特異性高、靈敏度高的試劑盒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢血清 本實(shí)驗(yàn)室保存的牛羊血清1 278份。任選1份已確定的羊陽(yáng)性血清，按照20～2-9進(jìn)行10倍倍比稀釋，共10份。

1.1.2 檢測(cè)試劑盒 BTV抗體B-ELISA 檢測(cè)試劑盒（以下簡(jiǎn)稱YN BTV B-ELISA）：昆明海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心試制，批號(hào)HM181005；BTV VP7蛋白抗體ELISA檢測(cè)試劑盒（以下簡(jiǎn)稱ID.VET C-ELISA）：法國(guó)ID.VET公司研制，批號(hào)C42。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 符合率比較 用2種ELISA試劑盒，對(duì)1 278份血清進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟和結(jié)果判定均參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。參考吳泰相等[10]的方法（表1），計(jì)算符合率、相對(duì)敏感性和相對(duì)特異性。符合率=(a+d)/(a+b+c+d)；相對(duì)敏感性=a/(a+c)；相對(duì)特異性=d/(b+d)；Kappa值計(jì)算公式：Kappa=2(ad-bc)/(p1q2+p2q1)。Kappa值 ＞0.8，表明一致性極高；0. 60＜Kappa值≤0. 80；表明高度一致；0. 40＜Kappa值≤0. 60；表明中度一致；Kappa值≤0. 40，表明一致性差[11]。

表1 兩種試劑盒一致性判定方法

1.2.2 敏感性比較 任選一份已確定的陽(yáng)性血清，按照20～2-9進(jìn)行10倍倍比稀釋，共10份，分別用2種ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)濃度的血清均做雙孔檢測(cè)，操作步驟參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。取2個(gè)檢測(cè)孔的OD平均值進(jìn)行判定，比較兩種試劑盒的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 符合率比較

用上述方法對(duì)1 278份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。YN BTV B-ELISA試劑盒與ID VET C-ELISA試劑盒檢測(cè)比較結(jié)果顯示，兩者同時(shí)為陽(yáng)性和陰性血清分別有267份、1 010份，YN BTV B-ELISA試劑盒陽(yáng)性而ID.VET C-ELISA試劑盒陰性的血清0份，YN BTV B-ELISA試劑盒陰性而ID.VET C-ELISA試劑盒陽(yáng)性的血清1份。YN BTV B-ELISA試劑盒與ID.VET C-ELISA試劑盒的符合率、相對(duì)敏感性、相對(duì)特異性分別是：(267+1 010)/1 278×100%=99.92%，267/268×100%=99.63%，1 010/1 010×100%=100%。將兩者一致性用Kappa值表示，Kappa =2(267×1 010-0×268)/(267×1 010+268×1 011)≈0. 998。

表2 YN BTV B-ELISA試劑盒與ID.VET C-ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 敏感性比較

用上述方法對(duì)10個(gè)濃度的陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。同一份陽(yáng)性血清10個(gè)濃度稀釋后的檢測(cè)結(jié)果顯示，ID.VET C-ELISA試劑盒檢測(cè)到的最低濃度為2-4，即按照1:16稀釋，而YN BTV B-ELISA試劑盒能檢測(cè)到的最低濃度為2-7，即按照1:128稀釋。檢測(cè)結(jié)果表明，YN BTV B-ELISA試劑盒的敏感性更高。

表3 YN BTV B-ELISA試劑盒與ID.VET C-ELISA 試劑盒敏感性比較

3 討論

兩種試劑盒設(shè)計(jì)原理相同，均為基因工程表達(dá)的VP7蛋白預(yù)包被ELISA板，反應(yīng)程序均為加樣品后孵育一定時(shí)間，不洗板，加HRP標(biāo)記的單抗，反應(yīng)一定時(shí)間后，洗板，顯色。根據(jù)對(duì)1 278份樣品檢測(cè)的比較評(píng)估，發(fā)現(xiàn)兩者的符合率較高，因而推測(cè)兩種試劑盒的單抗可能作用于VP7蛋白的同一靶位點(diǎn)。反映試驗(yàn)判定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果一致性的2個(gè)指標(biāo)是符合率和Kappa值，而反映試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性是特異性和敏感性[12-13]。試劑盒敏感性高低會(huì)直接影響對(duì)同一樣品的判定，在檢測(cè)時(shí)敏感性低，對(duì)弱陽(yáng)性樣品會(huì)出現(xiàn)假陰性，漏檢的可能性增加。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，實(shí)驗(yàn)室在使用試劑盒前應(yīng)對(duì)其進(jìn)行測(cè)試驗(yàn)證。在測(cè)試驗(yàn)證時(shí)，測(cè)試樣品的范圍要廣，應(yīng)盡可能多地選取不同的、有代表性的測(cè)試樣品[14]。本次測(cè)試的樣品為來(lái)自澳大利亞、新西蘭和云南邊境地區(qū)的牛羊血清，樣品范圍在動(dòng)物品種上涵蓋了牛和羊，在地域上涵蓋了國(guó)內(nèi)和國(guó)外，因而具有一定的代表性。

4 結(jié)論

本次比對(duì)結(jié)果表明，YN BTV B-ELISA試劑盒與ID.VET C-ELISA檢測(cè)試劑盒之間的符合率、相對(duì)特異性、相對(duì)敏感性都較高，在動(dòng)物疫病群體檢測(cè)中無(wú)根本性差別，并且YN BTV B-ELISA試劑盒的敏感性更高，成本更低。這些特點(diǎn)表明YN BTV B-ELISA試劑盒在大規(guī)模樣品檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)更加明顯。