吳 琴，伍 玲，陳 謙，楊 敏，高 鵬，陳 浩，黃 敏

（四川省原子能研究院/輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610101）

藠頭（Allium chinense），別稱薤，百合科蔥屬植物［1］，廣泛分布于我國(guó)南方地區(qū)。藠頭富含多種活性物質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)及人體必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，是藥食同源珍品，素有“菜中靈芝”之美譽(yù)［2］。據(jù)李時(shí)珍《本草綱目》記載，藠頭具有殺菌、健胃、平喘以及治療心腦血管疾病等功效［3］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，藠頭具有開胃健脾、調(diào)節(jié)腸道、增進(jìn)食欲和殺菌止瀉等多種功效［4］，具有很大的開發(fā)潛力，已被國(guó)家農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《特色農(nóng)產(chǎn)品區(qū)域布局規(guī)劃（2013—2020）》列為重點(diǎn)發(fā)展農(nóng)產(chǎn)品之一。但目前我國(guó)的藠頭加工還處于初級(jí)階段，多被簡(jiǎn)單腌制用以佐餐，產(chǎn)品形式單一，不利于藠頭精深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。通過提取藠頭中的活性物質(zhì)再加以利用，充分開發(fā)其價(jià)值，提高其加工附加值，豐富產(chǎn)品形式，對(duì)于帶動(dòng)整個(gè)藠頭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義［5］。大量研究表明，藠頭對(duì)多種致病菌都有明顯的抑制作用，具有開發(fā)抗真菌藥物和食品防腐劑的潛力［6-7］。此前普遍認(rèn)為，蔥屬植物的主要抑菌成分為含硫化合物——蒜素（allicin），相關(guān)研究也主要集中于蒜素的提取及純化等方面［8-10］。我國(guó)藥典記載，中藥薤白為新鮮鱗莖用水浸煮或蒸過后干燥而成，中醫(yī)臨床上使用的是薤白水煎劑，而經(jīng)浸煮與干燥加工后，由于揮發(fā)性強(qiáng)，含硫化合物在干燥藥材和湯藥中其實(shí)已經(jīng)殘留不多，因此很難說含硫化合物是藠頭的主要抑菌成分［11］。陳艷麗的研究結(jié)果表明，以藠頭加工廢棄物為原料獲取的蒜素提取液其抑菌能力不顯著［12］。且有報(bào)道表明，藠頭中的皂苷類化合物也具有一定抑菌效果［13］，可見，藠頭的抑菌功效可能是多種成分的共同作用，單獨(dú)以蒜素含量作為藠頭抑菌成分提取優(yōu)化的指標(biāo)并不適宜，直接以抑菌效果作為其評(píng)價(jià)指標(biāo)理應(yīng)更加可靠。因此，本試驗(yàn)以藠頭提取液對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制效果為指標(biāo)對(duì)其提取條件進(jìn)行研究，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化藠頭抑菌成分的提取工藝，以期為以藠頭為來源的天然抑菌劑的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藠頭，購自四川省成都市內(nèi)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；纖維素酶［濾紙酶活力≥4萬U/g；CMCNa活力≥100萬U/g；C1酶活力≥3萬U/g，1 g酶粉于50℃、pH值為4.8條件下，1min水解底物（濾紙、CMC、脫脂棉或水楊素）產(chǎn)生1μg葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位］、中性蛋白酶（酶活≥10萬U/g，1 g固體酶粉在40℃、pH值為7.5條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位）和果膠酶（酶活≥3萬U/g，1 g酶粉于50℃、pH值為3.5條件下，1 h催化果膠水解生成1 mg半乳糖醛酸的酶量為1個(gè)果膠酶活力單位），均購自于寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純），均購自成都市科龍化工試劑廠；菌種：金黃色葡萄球菌（S.aureus），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市金城國(guó)勝試驗(yàn)儀器廠）、BSA224S-CW 電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］、Eppendorf centrifuge 5810R 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf股份公司）、ELELA FDU-2110冷凍干燥機(jī)（ELELA日本東京理化株式會(huì)社）、Mettler-Toledo-S210 pH計(jì)［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］、DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藠頭粗提液的制備［7］將新鮮藠頭清洗除雜，晾干，紫外照射15 min滅菌，用攪拌機(jī)破碎，按比例加入提取溶劑混勻，調(diào)節(jié)混合物pH值，攪拌狀態(tài)下水浴浸提一定時(shí)間，提取液經(jīng)4層紗布過濾，8 000 r/min離心5 min，取上清液，即為藠頭粗提液。

1.3.2 抑菌試驗(yàn) 供試菌種劃線2次，挑取生長(zhǎng)旺盛的菌落接種于液體NA培養(yǎng)基中，在溫度為36℃，150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。將活化的金黃色葡萄球菌以生理鹽水稀釋成106CFU/mL的菌懸液，取100μL菌懸液涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上，其上間隔均勻放置牛津杯，在牛津杯中分別加入0.2 mL藠頭粗提液，以無菌水為對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑［13］。

1.3.3 藠頭預(yù)處理方法對(duì)其抑菌成分的影響 稱取4份相同質(zhì)量（50 g）的新鮮藠頭，分別在溫度為4℃條件下冷藏1個(gè)月、-18℃冷凍1個(gè)月、40℃熱風(fēng)完全干燥、4%（質(zhì)量比）NaCl鹽漬處理后真空包裝貯藏1個(gè)月，按“1.3.1”節(jié)中的方法在相同條件下進(jìn)行提取，以新鮮藠頭為對(duì)照，按“1.3.2”節(jié)中的方法測(cè)定不同預(yù)處理藠頭提取物的抑菌效果。

1.3.4 藠頭抑菌成分提取方法 熱水浸提法：稱取50 g新鮮藠頭，破碎后加入50mL超純水混勻，混合物攪拌狀態(tài)下于50℃水浴中保持1 h。

乙醇提取法：稱取50 g新鮮藠頭，破碎后分別加入50 mL濃度為50%（體積比）的乙醇溶液混勻，混合物攪拌狀態(tài)下于50℃水浴中保持1 h。

酶輔助提取法：稱取50 g新鮮藠頭，破碎后分別加入50 mL超純水混勻，混合物分別加入藠頭干質(zhì)量0.5%（質(zhì)量比）的中性蛋白酶（pH值＝7.5）、纖維素酶（pH值＝4.8）、果膠酶（pH值＝3.5），以0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值，攪拌狀態(tài)下于50℃水浴1 h。

將提取液按“1.3.2”節(jié)中所述進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，考察不同提取方法對(duì)藠頭提取物抑菌效果的影響。

1.3.5 果膠酶輔助提取藠頭抑菌成分的單因素試驗(yàn) 稱取50 g新鮮藠頭，分別考察pH值［3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、自然pH值（6.0）］、果膠酶添加量（0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%）、提取時(shí)間（30、45、60、75、90 min）、水浴溫度（40、45、50、55、60℃）、料液比［1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）］對(duì)藠頭提取物抑菌效果的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)提取物抑菌效果影響較為顯著的因素（提取時(shí)間、料液比、pH值）為響應(yīng)變量（表1），以提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0軟件中Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化藠頭抑菌成分提取的工藝條件，從而得到最佳的提取工藝。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Oringin 7.5軟件作圖，用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對(duì)藠頭提取物抑菌活性的影響

藠頭采收期短，且儲(chǔ)存中容易發(fā)芽變質(zhì)，須進(jìn)行一定處理以延長(zhǎng)其保存期，因此考察不同處理方式及條件對(duì)藠頭提取物抑菌活性的影響。

由表2可知，新鮮藠頭對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制效果，經(jīng)冷藏后，抑菌效果稍有下降，而經(jīng)冷凍、干燥、鹽漬處理后的藠頭，完全沒有抑菌效果，說明藠頭的抑菌成分在冷藏環(huán)境下能較好地保存，在冷凍、干燥及鹽漬加工處理過程中極易損失，降低了藠頭的產(chǎn)品附加值。從新鮮藠頭中直接提取抑菌成分加以利用，能更充分發(fā)揮其功效，體現(xiàn)其藥食兩用價(jià)值。

表2 預(yù)處理方式對(duì)藠頭提取物抑菌活性的影響

2.2 提取方法對(duì)藠頭提取物抑菌效果的影響

不同提取方法得到的提取物成分往往有極大差異，采用常見的熱水浸提法、乙醇提取法、酶輔助提取法對(duì)藠頭分別進(jìn)行提取。由圖1可以看出，在相同條件下，藠頭的果膠酶輔助提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑最大，為25.36 mm，纖維素酶提取物其次，中性蛋白酶提取物與水提取物相差不大，50%乙醇溶液提取物抑菌作用最弱。這是因?yàn)樗婎^細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠等物質(zhì)組成，果膠酶和纖維素酶能極大促進(jìn)其分解，使藠頭中的抑菌成分更充分快速溶出，粗提物的抑菌性能也隨之提高。藠頭的乙醇提取物抑菌作用較弱，可能是由于藠頭中含有的蛋白質(zhì)和多糖與乙醇發(fā)生沉淀反應(yīng)，包裹了一定量的抑菌成分，使其難以溶出［14］；也有可能是抑菌成分在50%乙醇溶液中溶解性差，從而降低了抑菌效果。因此，本試驗(yàn)選擇果膠酶輔助法優(yōu)化提取藠頭的金黃色葡萄球菌抑菌成分。

2.3 pH值對(duì)果膠酶輔助提取藠頭抑菌成分的影響

在選擇果膠酶輔助提取的前提下，考察不同pH值對(duì)藠頭提取物抑菌效果的影響。由圖2可知，pH值對(duì)藠頭提取物抑菌活性的影響十分明顯，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果隨著pH值的增加而降低，在pH值為3.0處具有最大抑菌圈直徑，其提取物抑菌效果最強(qiáng)。這是因?yàn)楣z酶的最適宜pH值為3.0，在此條件下能最大程度發(fā)揮其酶活力，且酸性條件有利于破壞藠頭組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)抑菌成分溶出。

2.4 果膠酶添加量對(duì)藠頭提取物抑菌活性的影響

由圖3可以看出，果膠酶的添加量對(duì)藠頭提取物抑菌作用有明顯影響，在一定范圍內(nèi)，提取物抑菌效果隨果膠酶添加量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)果膠酶添加量為0.7%時(shí)有最大抑菌圈直徑，為26.45 mm，當(dāng)添加量超過0.7%時(shí)提取物的抑菌圈直徑增幅不大，說明添加少量的果膠酶就可明顯提高提取物的抑菌性能，從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，最適宜的果膠酶添加量為0.7%。

2.5 提取時(shí)間對(duì)藠頭提取物抑菌活性的影響

由圖4可以看出，提取時(shí)間對(duì)藠頭提取物抑菌活性有明顯影響，藠頭提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，抑菌圈直徑最大，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，浸提液中的抑菌成分則開始降解失活，提取液的抑菌性能隨之降低。

2.6 提取溫度對(duì)藠頭提取物抑菌活性的影響

在溫度為40、45、50、55、60℃條件下，分別提取藠頭抑菌成分，考察溫度對(duì)提取物抑菌效果的影響。由圖5可知，藠頭提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑隨提取溫度的升高而逐漸增大，當(dāng)提取溫度升高至50℃時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大值，溫度繼續(xù)升高，提取液的抑菌性能開始下降。這是因?yàn)楣z酶的最適宜使用溫度為50℃，超過酶的最佳使用溫度后，果膠酶因高溫失活，無法發(fā)揮其輔助效果。

2.7 料液比對(duì)藠頭提取物抑菌效果的影響

由圖6可知，料液比對(duì)藠頭提取物抑菌效果的影響十分明顯，抑菌圈直徑隨料液比的增大而增大，當(dāng)料液比為1 g∶4 mL時(shí)，增大趨勢(shì)減緩。料液比過大，溶劑回收時(shí)間和成本增加，不利于后續(xù)工作進(jìn)行，因此不宜選擇過大料液比。

2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

固定提取溫度為50℃、果膠酶添加量為0.7%，以pH值、提取時(shí)間、料液比為自變量，提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑（y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。共設(shè)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)，每組樣品重復(fù)3次［15］。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

經(jīng)二次回歸擬合后求得響應(yīng)函數(shù)，回歸方程為y＝24.19-0.87A+1.39B+2.38C+0.4AB-0.11AC-0.71BC-1.62A2-1.97B2+1.72C2。

由表4可知，該回歸模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），對(duì)提取液抑菌影響程度表現(xiàn)為C＞B＞A，即料液比＞提取時(shí)間＞pH值，一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2和交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。模型的回歸系數(shù)（R2）為0.990 3，說明模型擬合度較好。失擬項(xiàng)P＝0.084 7＞0.05，差異不顯著，調(diào)整決定系數(shù)（＝0.977 7）接近l，變異系數(shù)（CV）僅為1.67%，表明該模型方程可用來分析和預(yù)測(cè)不同提取工藝條件下藠頭提取物抑菌圈直徑的最佳理論值［16］。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)回歸方程，作出各因素間交互作用對(duì)提取物抑菌性能影響的響應(yīng)面及等高線。由圖7可知，提取時(shí)間與料液比之間的交互作用十分顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，隨著數(shù)值的增加，響應(yīng)值變化較大。其他因素間交互作用較小。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

Design-Expert8.0分析結(jié)果表明，在pH值為3.71，提取時(shí)間為62.17 min，料液比為1 g∶5 mL時(shí)，可達(dá)到提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的理論最大抑菌圈直徑，為（28.47±0.06）mm。為驗(yàn)證響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用理論最佳提取條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，在實(shí)際操作過程中將試驗(yàn)因素調(diào)整為pH 值為3.7、提取時(shí)間為62 min、料液比為1 g∶5 mL，做3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得藠頭提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為28.42 mm。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相符，證實(shí)回歸模型可靠。

3 討論

通過單因素試驗(yàn)，確定藠頭抑菌成分提取宜選用果膠酶輔助提取法，且提取溫度最佳為50℃、果膠酶添加量達(dá)到原料質(zhì)量的0.7%為宜，再進(jìn)一步根據(jù)響應(yīng)面分析得出，在果膠酶法提取藠頭抑菌成分時(shí)，各因素對(duì)提取物抑菌性能的影響表現(xiàn)為料液比＞提取時(shí)間＞pH值。應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝參數(shù)為料液比為1 g∶5 mL、pH值為3.7、提取時(shí)間為62 min，在此條件下得到提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為28.42 mm。研究表明，基于響應(yīng)面法分析所得的優(yōu)化藠頭提取抑菌成分工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。以藠頭提取物為原料制備天然抑菌劑還有待進(jìn)一步研究。