王曉昌，許 可，黃 悅，羅 麗

(西安建筑科技大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055)

微藻常見于湖泊水體環(huán)境中，氮和磷是其生長和繁殖的必需營養(yǎng)物質(zhì).在多種自然水體中，80.6%的氮元素是以硝態(tài)氮的形式存在的[1]，磷酸鹽磷也被認為是自然水體中植物生長最主要的限制性元素[2].藻類的光合作用是吸收光能通過光化學(xué)反應(yīng)發(fā)生電荷分離，將光能轉(zhuǎn)化為電能；同時分離后的電子與質(zhì)子以電子傳遞的方式，使電能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，生成ATP與NADPH，從而進行生命活動.磷元素一般以磷酸根的形式存在于植物體內(nèi)，在生成和消耗ATP的過程中起著能量傳遞的作用[3]，能影響微藻對光能的轉(zhuǎn)換和利用[4]，進而影響生長速率和光合作用[5].

過低的磷濃度會阻礙微藻的生長，削弱其光合效率，被吸收的過量光能會轉(zhuǎn)換為熱和熒光發(fā)射.所以利用葉綠素熒光技術(shù)能通過測定反映光合活性的熒光參數(shù)，在一定程度上反映微藻受脅迫的程度[6,7].國內(nèi)外已有一些有關(guān)葉綠素熒光法研究營養(yǎng)鹽脅迫對微藻光合作用影響的報道.Li等[8]發(fā)現(xiàn)光系統(tǒng)PSII是感應(yīng)磷脅迫最靈敏的復(fù)合體，而PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)常用于研究植物的脅迫反應(yīng)，對環(huán)境變化的感應(yīng)較為靈敏，使用頻率最高[9].微藻的Fv/Fm值一般穩(wěn)定在0.65左右，不同藻類間有一定差異，但在脅迫條件下此參數(shù)通常呈下降趨勢[10,11].Beardall等[5]研究發(fā)現(xiàn)磷缺乏導(dǎo)致二形柵藻在培養(yǎng)后期生長受到限制，光合電子傳遞能力降低，藻細胞光合作用受抑制.目前來說，國內(nèi)采用調(diào)制葉綠熒光成像系統(tǒng)對于赤潮藍藻與高等植物的相關(guān)研究較為豐富，但對淡水藻種的這一指標研究還比較少[6].

地表水環(huán)境水體中藍藻、綠藻為優(yōu)勢種類，且小球藻最為常見[12].本研究以普通小球藻(Chlorellavulgaris)作為研究對象，具有生長快、繁殖迅速的特點，是富營養(yǎng)化常見藻種之一.本研究通過測定小球藻的常規(guī)生物量指標、對硝氮、正磷酸鹽的利用情況以及葉綠素熒光參數(shù)的變化，分析了低磷濃度下小球藻生長及光合作用效率變化的相關(guān)性，根據(jù)普通小球藻的光合活性快速判斷小球藻的是否處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)以及受脅迫情況.

1 材料與方法

1.1 實驗藻種的選擇

研究對象選擇普通小球藻(Chlorellavulgaris)，編號：FACHB-24，購自中科院武漢生物研究所.

1.2 培養(yǎng)基配制

實驗采用的氮和磷分別以NaNO3和K2HPO4為原料，參考《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB3838-2002)V類水水質(zhì)，同時參考易文利等[13]的對太湖中優(yōu)勢綠藻的模擬實驗，得到藻類的最佳生長磷濃度為P=0.445 mg/L，設(shè)置了表1所示的氮磷濃度.除氮和磷之外，其余營養(yǎng)元素均參考BG-11培養(yǎng)液的配方以及生長環(huán)境進行設(shè)定[14].分別在1000 mL錐形瓶中加入配制的500 mL不同氮磷濃度梯度的培養(yǎng)基，將其于121 ℃滅菌30 min，滅菌完成后置于無菌操作臺中冷卻至室溫，保存待用.

表1 不同實驗組的初始氮磷濃度設(shè)定

1.3 藻種的培養(yǎng)

首先用BG-11培養(yǎng)基在恒溫生化培養(yǎng)箱(MGC-250P，上海一恒，中國)中將小球藻培養(yǎng)至對數(shù)期，使藻密度達到2～3×106cells·mL-1.然后對小球藻進行饑餓預(yù)處理：取適量藻液以4 500 r/min的轉(zhuǎn)速于常溫條件下，離心20 min，去除上清液，用磷酸緩沖鹽溶液將沉淀物洗出，重復(fù)3次.在無菌操作臺上接入去除氮、磷的BG-11培養(yǎng)液，進行饑餓處理，共4天.最后將饑餓處理后的藻種接入不同氮磷梯度培養(yǎng)基中，初始接種密度是2×105cells·mL-1，并放入25 ℃光照培養(yǎng)箱中，供給5 000 1ux的光照強度進行培養(yǎng)，光照和黑暗時間分別設(shè)為12 h∶12 h，每天隨機改變位置均勻照光，定時搖瓶三遍.

1.4 實驗分析方法

1.4.1 藻細胞密度(AD)的測定

采用細胞計數(shù)分析儀(Cellometer? auto T4 , Nexcelom , USA)、細胞計數(shù)板(Nexcelom Bioscience , Cellometer Auto T4 slide)進行藻細胞計數(shù).用SPSS 20.0.0軟件做數(shù)據(jù)的顯著性分析.

1.4.2 葉綠素a含量的測定

采用熱乙醇提取小球藻的葉綠素a，并用紫外可見吸收光譜法測量其含量[15].

1.4.3 氮磷的測定

培養(yǎng)基中硝酸鹽的測定采用雙波長檢測法[16]，并采用孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法測定磷含量(GB11894-89)[17].

1.4.4 葉綠素熒光參數(shù)的測定

本次實驗采用調(diào)制葉綠素熒光儀(MAXI Imaging PAM，德國，WALZ)測量小球藻的葉綠素熒光參數(shù)[18]，檢測其光合作用變化.取2 mL微藻樣品，在暗適應(yīng)15分鐘后測量光誘導(dǎo)熒光曲線.測定程序為：先以弱光照射測量初始熒光(Fo)，然后進行飽和脈沖光(2 800 μmol·m-2·s-1)處理，以一個脈沖光為單位激發(fā)，隨后關(guān)閉，產(chǎn)生最大熒光值(Fm)，之后打開可以引起藻光合作用的作用光(75 μmol·m-2·s-1)，待熒光穩(wěn)定后再進行飽和脈沖光照射，一次脈沖結(jié)束后產(chǎn)生光化光獲得的最大熒光(Fm′).其他參數(shù)數(shù)值均是在選定模式下系統(tǒng)自動計算生成.Fv/Fm可以通過式(1)、(2)分別計算[7]：

ФPSII=Yield=(Fm′-F)/Fm′=ΔF/Fm′

(1)

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm

(2)

式中：Fv為可變熒光，ФPSII和Yield均為作用光存在時PSII實際的光化學(xué)量子產(chǎn)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 低磷濃度對普通小球藻藻密度(AD)的影響

固定磷濃度P=0.2、0.4 mg/L，不同氮濃度條件下，實驗組的AD值差異較小(P>0.05)，而P=0.5、1 mg/L條件下，AD值差異顯著(P<0.05).由此可知實驗磷濃度條件下，P≤0.4 mg/L為小球藻增長的限制因素.

不同營養(yǎng)條件對小球藻的AD值影響如圖1所示.由圖可知，磷濃度從0.2增至0.4 mg/L時，AD值均隨之增大，最終AD值約從4.30×106～5.20×106cells·mL-1增至4.20×106～7.10×106cells·mL-1.當P>0.4 mg/L時，各組最終AD值約為3.0×106～7.4×106cells·mL-1，由此可知P<0.4 mg/L時，提高磷濃度能促進小球藻的生長；P>0.4 mg/L時，提高磷濃度對小球藻增殖的促進效果不顯著.所以在試驗氮磷營養(yǎng)濃度下，P=0.4 mg/L時最適宜小球藻生長.楊坤等[19]研究得出在0.47 mg/L磷濃度條件下，小球藻藻密度達到最大.這與本研究結(jié)論一致.同時研究結(jié)果表明：P<0.4 mg/L時，氮濃度與AD值的相關(guān)性不顯著，且較高濃度的氮供給對小球藻繁殖有抑制作用，可能是因為P<0.4 mg/L時，磷元素為主要限制因子，會阻礙小球藻增長；而當P>0.4 mg/L條件下，AD會隨著氮濃度的增高而增大，導(dǎo)致不同氮濃度供應(yīng)條件下的AD差異顯著.

圖1 不同營養(yǎng)條件下普通小球藻的生長狀況Fig.1 The growth status of C. vulgaris with different nutrient concentration

2.2 低磷濃度對培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽吸收的影響

在不同初始氮磷濃度下，普通小球藻對N和P的吸收率見圖2.根據(jù)圖2(a)可知：在培養(yǎng)基中P<0.4 mg/L的條件下，外源磷濃度從0.2 mg/L增加到0.4 mg/L時，在N=1、2、3、6、8 mg/L情況下，小球藻對硝氮吸收率分別增加了21.5%、14.2%、9.4%、5.2%和4.6%，表明低磷條件下，磷濃度的增高有利于硝氮被吸收，提高磷濃度有助于小球藻吸收硝氮，表明此時氮吸收率只與初始磷濃度有關(guān)；而當培養(yǎng)基中P>0.4 mg/L時，小球藻對硝態(tài)氮的吸收率同時受到N、P供給濃度的綜合影響，且在N=2 mg/L時，氮的吸收率達到最大，為95.4%.此時若繼續(xù)提高供給氮濃度，氮的吸收率會不升反降.同時，當?shù)獫舛容^低時(N≤3 mg/L)，固定氮供給濃度，提高磷供給水平會促進氮的吸收率，接近100%.磷被消耗完后，氮的吸收速率會隨之降低.

由圖2(b)可知：初始供給磷濃度的不同致使各處理組達到100%磷去除率的時間不同.當P=1 mg/L時小球藻對磷的吸收利用集中在第5～7天，比磷吸收利用集中在前5天的其余低濃度處理組要晚一些.有研究表明，聚球藻(Synechococcussp)在磷饑餓處理后的磷吸收速率比磷富足時快100倍[20]，同本實驗結(jié)果相近.P=0.2 mg/L的處理組中，氮濃度的增加會削弱小球藻吸收正磷酸鹽的能力；P=0.4 mg/L處理組中在N=2 mg·L-1時小球藻對磷的吸收效果最好，繼續(xù)提高氮濃度反會降低磷的吸收率；而P>0.4 mg/L時，氮濃度的增加促進小球藻吸收正磷酸鹽.這一結(jié)果也進一步證明了在P<0.4 mg/L時，磷是主要限制小球藻的增長的營養(yǎng)元素.

圖2 不同營養(yǎng)條件下普通小球藻每日吸收率Fig.2 Daily absorption rate of C. Vulgaris with different nutrient concentration

2.3 低磷濃度對葉綠素a含量的影響

不同氮、磷濃度對小球藻的葉綠素a含量影響如圖3所示，各實驗組葉綠素濃度隨時間基本呈現(xiàn)先增后降的趨勢.四組不同磷濃度條件下小球藻的葉綠素濃度，在對數(shù)生長末期分別降低了55.05%～72.17%、0～41.25%、28.13%～49.55%、38.66%～64.95%.其中P=0.2 mg/L處理組在生長末期的葉綠素濃度最低，降幅最大.從圖2(b)可以看出，P=0.2 mg/L處理組在實驗初期培養(yǎng)基中的磷就被完全吸收，而由于沒有外源營養(yǎng)供給，需要小球藻利用內(nèi)部存儲的氮、磷供細胞生長[21]，且氮是組成葉綠素的主要元素之一，因此會引起葉綠素a的變化.而當P=0.4，0.5和1 mg/L時，氮供給充足時(N≥6 mg/L)，磷會在對數(shù)末期被完全吸收，該條件下葉綠素a增長較穩(wěn)定；而N<6 mg/L條件下，葉綠素的合成會因營養(yǎng)供給不足而受阻，同樣地，此時藻細胞會利用自身儲存的葉綠素作為氮源進行生長，從而致使葉綠素a濃度降低，說明低磷條件下，葉綠素a會隨著氮濃度的增加而增加；但P<0.2 mg/L時，小球藻色素的合成會收到抑制.

圖3 不同營養(yǎng)條件下普通小球藻葉綠素a的變化情況Fig.3 Chlorophyll-a trend of C. vulgaris with different nutrient concentration

2.4 低磷濃度對葉綠素熒光的影響

不同初始氮磷濃度對普通小球藻光合作用效率的影響如圖4，各實驗組葉綠素熒光值Fv/Fm均隨培養(yǎng)時間先增加后降低.其中，P=0.2 mg/L，處理組的Fv/Fm降幅最大，并在培養(yǎng)第6天達到0.52～0.57，隨后開始在第7天迅速大幅度降低至0.21～0.28，至實驗結(jié)束后該值穩(wěn)定在0.18～0.24，較峰值降低了58%～63%，充分證明該實驗組進入磷脅迫狀態(tài)，藻細胞的光合作用能力受到影響[6].另外，如圖1(a)和圖3(a)所示，P=0.2 mg/L實驗組AD值和葉綠素a濃度從第8天分別開始停止增長和明顯降低，表明這一時期藻類的細胞分裂及色素合成均受到了抑制.根據(jù)上述結(jié)果，F(xiàn)v/Fm對磷濃度變化的敏感度要高于AD值以及葉綠素a.剩余實驗組(P=0.4、0.5和1 mg/L)的Fv/Fm值隨培養(yǎng)周期的變化均顯示平緩下降，說明該實驗組培養(yǎng)基中外源磷被完全利用后導(dǎo)致了磷缺乏，小球藻的生長因此受到了磷限制，這與P=0.2 mg/L實驗組發(fā)生的磷脅迫并不相同.且這三個實驗組中，當N<3 mg/L時，F(xiàn)v/Fm值均出現(xiàn)明顯降低，降幅為33%～54%.同時，實驗結(jié)果表明，氮濃度越小，F(xiàn)v/Fm出現(xiàn)下降的時間越早，降幅越明顯.這是由于氮的缺乏影響了葉綠體中色素的合成，進一步削弱了小球藻的光合作用能力，主要表現(xiàn)為光合作用效率值Fv/Fm的下降，以及電子傳遞速率的減緩[22].Fv/Fm對藻類在脅迫條件下的變化更為敏感，所以Fv/Fm適合用作判斷低(或缺)磷的光合作用指標.

圖4 不同營養(yǎng)條件下普通小球藻葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm的變化情況Fig.4 Trend of chlorophyll fluorescence parameter Fv/Fm of C. vulgaris with different nutrient concentration

3 結(jié)論

本實驗培養(yǎng)營養(yǎng)條件下(NO3-N: 1～8 mg/L；PO43-P: 0.2～1.0 mg/L)，小球藻的生長以及藻密度變化主要受到磷濃度變化的影響，并在P=0.4 mg/L時其生長狀態(tài)最佳；其最終生物量維持在3×106-7×106cells·mL-1.P<0.4 mg/L的條件下，磷濃度的增高有利于硝態(tài)氮被吸收，氮濃度變化對于小球藻生長影響不顯著.而當P>0.4 mg/L時，小球藻生長同時受到氮和磷濃度的影響，外源氮和磷供給水平越高越利于小球藻對磷和氮的吸收.此外，在低磷環(huán)境中，氮濃度增高可促進小球藻葉綠素a的積累，但過低的磷濃度(P=0.2 mg/L)會抑制葉綠素a的合成.實驗結(jié)果表明，普通小球藻發(fā)生磷脅迫時的Fv/Fm閾值為0.18～0.24，其余實驗條件均為磷限制.低磷濃度下，F(xiàn)v/Fm與小球藻的AD值、營養(yǎng)鹽變化及葉綠素a含量的相關(guān)性高，且對營養(yǎng)條件的變化更為敏感，因此Fv/Fm值用來研究營養(yǎng)鹽對微藻的脅迫作用，具有較高的可靠性.