宋祥軍 ，邱明宇，朱雪婷，涂健，劉紅梅，邵穎，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

腸外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)能夠引起不同宿主腸外組織的感染，可導(dǎo)致不同宿主發(fā)生腦膜炎、敗血癥以及泌尿系統(tǒng)感染等疾病.對糞便的微生物篩查研究表明，ExPEC是一種腸道菌落，與共生大腸桿菌不同，ExPEC擁有的致病性毒力因子能夠在宿主腸道外引起多種腸外疾病[1-4].近年來，豬源ExPEC的分離率在逐年上升，ExPEC作為養(yǎng)豬業(yè)的主要病原體之一，其引發(fā)的疾病對養(yǎng)豬業(yè)可造成重大的經(jīng)濟損失[5].隨著工業(yè)化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬源ExPEC爆發(fā)的增長趨勢已成為我國亟需解決的問題[6].一般對于豬病的防治措施，包括開發(fā)具有良好前景的疫苗和使用合理有效的抗生素[7].目前，臨床上發(fā)生豬源ExPEC感染時，首選的治療方法是使用抗生素.但由于抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的盲目使用，使得豬源ExPEC的耐藥性迅速增加，耐藥譜越來越廣，整體耐藥水平升高，導(dǎo)致臨床上可供使用的有效抗生素越來越少，給臨床治療帶來了很大的困難和挑戰(zhàn).

本試驗通過對安徽省合肥地區(qū)送檢的感染ExPEC仔豬進行剖檢，通過無菌操作采集其腸外組織心臟、肝臟等，進行細菌的分離純化培養(yǎng)與16s rDNA PCR測序鑒定，將確定為豬源ExPEC的菌株進行種系發(fā)育分群試驗、毒力基因檢測、藥敏試驗以及小鼠致病性試驗，進一步了解該病原菌的致病性和流行病學(xué)規(guī)律，以期為該病的預(yù)防和臨床治療提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無菌采集合肥周邊地區(qū)送檢的感染ExPEC仔豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟，大腸桿菌藥敏質(zhì)控株ATCC 25922由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點實驗室保存，6～8周齡昆明小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心.

LB肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉、瓊脂糖、GelRed核酸染色液、5×TBE均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；麥康凱培養(yǎng)基(MAC)、伊紅美藍培養(yǎng)基(EMB)、三糖鐵培養(yǎng)基(Triple Sugar Iron Agar)均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；比濁管購自溫州市康泰生物科技有限公司；革蘭氏染液購自北京索萊寶科技有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 豬源腸外大腸桿菌的分離純化與鑒定 將采集的腸道外組織無菌接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～18 h；再挑取紅色圓形菌落接種于伊紅美藍培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取紫黑色帶金屬光澤的單菌落接種于LB固體培養(yǎng)基上進行純化.取純化后細菌適量涂布于載玻片上，進行革蘭氏染色鏡檢[8].將初步鑒定為大腸桿菌的菌落進行16S rDNA PCR測序鑒定[16].

1.2.2 豬源腸外大腸桿菌PCR分群 根據(jù)文獻，合成系統(tǒng)進化分群有關(guān)基因chuA、yjaA、TspE4C2的引物[9]，引物如表1所示，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行合成.

表1 目的基因、引物、目的片段大小

1.2.3 豬源腸外大腸桿菌毒力基因檢測 按GenBank公布的有關(guān)基因序列，合成11對ExPEC的毒力基因[10]：kpsMII、iutA、papC、sfaS、focG、afa、papA、hlyD、fyuA、ireA和vaT，引物序列見表2，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

表2 毒力基因、引物、目的片段的大小

1.2.4 藥物敏感試驗 采用紙片擴散法對分離到的30株豬源ExPEC進行藥敏試驗.將ExPEC菌株接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3～4 h后，取適量菌液與MH瓊脂培養(yǎng)基混勻，倒板，冷卻、凝固后，貼藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測定抑菌圈直徑，讀取并記錄結(jié)果.

1.2.5 小鼠致病性試驗 分別選取含有3個以上的毒力基因的菌株(Ex-P3、Ex-P5、Ex-P8、Ex-P14、Ex-P22、Ex-P23、Ex-P24、Ex-P26、Ex-P27、Ex-P30)，將66只昆明小鼠進行隨機分組，每組6只，設(shè)置1組對照組，以菌液濃度為2×107CFU/mL，向小鼠腹腔注射0.5 mL/只，對照組注射PBS緩沖液(0.5 mL/只)，注射后觀察記錄1周內(nèi)小鼠的死亡情況.

1.2.6 菌株Ex-P27基因組圈圖 利用高通量測序技術(shù)對Ex-P27菌株進行全基因組測序以獲取基因組序列圖譜，采用 Circos v0.69(http://circos.ca/)軟件進行基因組圈圖的繪制，通過基因組圈圖可以更直觀的了解基因在正、反義鏈上的分布情況、基因的GC含量、基因組島、同源基因等信息.

2 結(jié)果與分析

2.1 豬源ExPEC的分離株培養(yǎng)特性以及16S rDNA PCR測序鑒定

分離的菌株在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形紅色、濕潤光滑菌落；在伊紅美藍培養(yǎng)基上呈紫黑色帶金屬光澤的圓形菌落；在LB固體培養(yǎng)基上呈灰白色、光滑濕潤的菌落.鏡檢可見菌體被染成紅色、兩端鈍圓、單個、成對或成鏈狀排列，無芽孢.通過PCR擴增細菌16S rDNA基因進一步鑒定上述篩選的大腸桿菌，擴增片段大小為1 450 bp，經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，30株菌目的片段大小均與預(yù)期一致(圖1)；將PCR產(chǎn)物送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測序，序列結(jié)果在NCBI-BLAST搜索比對，鑒定標準按照同源性≥97%判定，可以確定篩選的大腸桿菌為豬源ExPEC.

M:DL2 000 DNA Marker；A：1為陰性對照；2～24為檢測菌株；B：1為陰性對照，2～8為檢測菌株.M:DL2 000 DNA Marker；A：1 for negative control，2～24 for detected strains；B:1 for negative control，2～8 for detected strains.圖1 16s rDNA PCR擴增Figure 1 16s rDNA PCR amplification

M：DL2 000 DNA Marker；A：1～3為菌株1(B1)，4～6為菌株2(A)，7～9為菌株3(D)，10～12為菌株4(B1)，13～15為菌株5(D)，16～18為菌株6(A)，19～21為菌株7(A)，22～24為菌株8(D)；B：1～3為菌株9(B2)，4～6為菌株10(B2)，7～9為菌株11(B1)，10～12為菌株12(B1)，13～15為菌株13(B1)，16～18為菌株14(A)，19～21為菌株15(D)，22～24為菌株16(B1)；C：1～3為菌株17(B1)，4～6為菌株18(B2)，7～9為菌株19(B1)，10～12為菌株20(B1)，13～15為菌株21(B1)，16～18為菌株22(B2)，19～21為菌株23(B2)；22～24為菌株24(D)；D：1～3為菌株25(D)，4～6為菌株26(B1)，7～9為菌株27(B1)，10～12為菌株28(B1)，13～15為菌株29(B1)，16～18為菌株30(B1)，19～21為陰性對照.M：DL2 000 DNA Marker；A:1～3 for strain 1(B1)，4～6 for strain 2(A)，7～9 for strain 3(D)，10～12 for strain 4(B1)，13～15 for strain 5(D) ，16～18 for strain 6(A)，19～21 for strain 7(A)，22～24 for strain 8(D)；B：1～3 for strain 9(B2)，4～6 for strain 10(B2)，7～9 for strain 11(B1)，10～12 for strain 12(B1)，13～15 for strain 13(B1)，16～18 for strain 14(A)，19～21 for strain 15(D)，22～24 for strain 16(B1)；C：1～3 for strain 17(B1)，4～6 for strain 18(B2)，7～9 for strain 19(B1)，10～12 for strain 20(B1)，13～15 for strain 21(B1)，16～18 for strain 22(B2)，19～21 for strain 23(B2)；22～24 for strain 24(D)；D：1～3 for strain 25(D)，4～6 for strain 26(B1)，7～9 for strain 27(B1)，10～12 for strain 28(B1)，13～15 for strain 29(B1) ，16～18 for strain 30(B1)，19～21 for negative control.圖2 基因chuA(279 bp)、yjaA(211 bp)、TspE4C2(152 bp)的PCR擴增Figure 2 PCR amplification of genes chuA，yjaA and TspE4C2

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分群的分群

分群結(jié)果顯示，30株豬源ExPEC有4株菌是屬于A群，15株菌屬于B1群，5株菌屬于B2群，6株菌屬于D群.30株豬源ExPEC的系統(tǒng)分群結(jié)果如圖2所示.

2.3 毒力基因的檢測

30株豬源ExPEC中，檢測合成的11種毒力基因結(jié)果顯示，vaT、iutA、kpsMII、hlyD、fyuA、ireA、afa7種毒力基因，檢出率分別為70.00%、33.33%、23.33%、20.00%、16.67%、3.33%、3.33%，而papC、sfaS、focG、papA這4種毒力基因并未擴增出目的條帶.檢出目的基因片段大小與陽性菌株擴增片段大小相符，毒力基因檢測結(jié)果的部分PCR圖，如圖3所示.

M:DL2 000 DNA Marker；A、B、C、D、E、F、G：1為陰性對照；A為毒力基因afa(594 bp)的擴增圖，2～10為檢測樣品，4為檢測出的陽性菌株；B為毒力基因fyuA(787 bp)的擴增圖，2～13為檢測樣品，2～5為檢測出的陽性菌株；C為毒力基因ireA(254 bp)的擴增圖，2～10為檢測樣品，8為檢測出的陽性菌株；D為毒力基因kpsMII(272 bp)的擴增圖，2～9為檢測樣品，6～9為檢測出的陽性菌株；E為毒力基因vaT(1 021 bp)的擴增圖，2～10為檢測樣品，3、5、6、8泳道為檢測出的陽性菌株；F為毒力基因iutA(314 bp)的擴增圖，2～9為檢測樣品，2、4、7泳道為檢測出的陽性菌株；G為毒力基因hlyD(904 bp)，2～10為檢測樣品，4泳道、6～9泳道為檢測出的陽性菌株.M:DL2 000 DNA Marker；A，B，C，D，E，F(xiàn)，G：1 for a negative control；A：amplification of virulence gene afa (594 bp)，2～10 for a test sample，4 for detection of the positive strain；B：amplification map of the virulence gene fyuA (787 bp)，2～13 for the test sample，2～5 for the positive strain detected；C：for the expansion of the virulence gene ireA (254 bp) ，2～10 for the detection of samples，8 for the detection of positive strains；D：amplification of the virulence gene kpsMII (272 bp)，2～9 for the detection of samples，6～9 for the detection of positive strains；E：amplification map of the virulence gene vaT (1 021 bp)，2～10 for the detection sample，lanes 3，5，6，and 8 for the positive strains detected；F：the amplification of the virulence gene iutA (314 bp)，2～9 shows the samples tested，lanes 2，4 and 7 for positive strains detected；G：virulence gene hlyD (904 bp)，2～10 for the test sample，lanes 4 and 6～9 for detected the positive strain.圖3 毒力基因的PCR檢測Figure 3 The result of PCR detection of virulence genes

2.4 藥敏試驗

對分離到的30株致病性大腸桿菌進行的常用22種抗生素的敏感性試驗，結(jié)果表明分離株對受試藥物存在不同程度的多重耐藥性，其中對氨芐西林、林可霉素、多西環(huán)素、利福平、桿菌肽的耐藥率最高，達到100%，對多粘菌素B的耐藥率最低為0%，但敏感率最高為93.33%，對米諾環(huán)素的中介率最高為63.33%，統(tǒng)計結(jié)果如表3所示.

2.5 致病性試驗

將本試驗中臨床分離到的含有3個及以上毒力基因的豬源ExPEC菌株腹腔注射接種小鼠，連續(xù)觀察1周的發(fā)病小鼠死亡情況為：Ex-P3(2/6)、Ex-P5(1/6)、Ex-P8(1/6)、Ex-P14(1/6)、Ex-P22(3/6)、Ex-P23(2/6)、Ex-P24(2/6)、Ex-P26(1/6)、Ex-P27(3/6)、Ex-P30(2/6)，對照組(0/6).死亡率最高的為Ex-P22和Ex-P27組小鼠，而Ex-P27組小鼠發(fā)病癥狀更嚴重，表現(xiàn)為采食量下降、行為能力減弱、顫抖、精神萎靡不振，被毛雜亂，因此選擇此菌株做測序驗證.

表3 30株豬源腸外致病性大腸桿菌的藥敏試驗

2.6 菌株Ex-P27基因組圈圖

對菌株Ex-P27的高通量測序結(jié)果，預(yù)測到4 995個編碼基因，其總長5 365 154 bp，平均長度1 074 bp.非編碼RNA預(yù)測中，rRNA有9個，分布在7個家族；tRNA有86個，分布在22個家族.利用已預(yù)測到的基因組信息，如重復(fù)序列、GC含量等，應(yīng)用Circos v0.69(http://circos.ca/)軟件繪制出菌株Ex-P27基因組圈圖(圖4).由外向內(nèi)第2圈和第3圈上，不同的顏色標識CDS不同的COG的功能分類，第5圈向外的紅色部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量，相反地，向內(nèi)的藍色部分表示GC含量低于平均水平，峰值高低表示與平均GC含量差值大小.如圖4所示，紅色和藍色部分交替頻繁，但峰值相近，說明該菌株GC含量波動頻繁，但波動幅度不大.

圖4 Ex-P27分離株基因組圈圖Figure 4 Genome circle map of Ex-P27 strain

3 討論

豬源ExPEC現(xiàn)已成為威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的主要細菌性疾病之一，本研究分離到的豬源ExPEC來源于合肥周邊送檢的病豬，通過無菌采集病豬的腸道外的組織分離到的細菌，經(jīng)純化培養(yǎng)及PCR測序鑒定分離了30株豬源ExPEC.

大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育進化群是采用兩步三重PCR，根據(jù)基因chuA、yiaA和TspE4序列將種系發(fā)育群分為4個群，分別為A、B1、B2、D.本試驗結(jié)果顯示，30株豬源ExPEC，B1群菌株為最多，其次是B2和D群，A群所占菌株最少.有研究報道，不同種群的毒力和致病性不同[11]，并發(fā)現(xiàn)對人具有致病性的ExPEC主要是B2群的菌株，D群的致病性次之.A群和B1群的菌株多是屬于共生型的，一般情況下不致病.ExPEC的致病性主要是通過某些毒力因子和宿主的相互作用，導(dǎo)致宿主發(fā)病.本試驗選取11種豬源ExPEC的毒力基因，用于進一步驗證種系發(fā)育群和毒力基因之間的關(guān)系，選取的毒力基因主要包含P-菌毛基因PapA、PapC；S菌毛：sfa；FIC菌毛：foc；非菌毛粘附素：afa；鰲鐵蛋白受或外膜蛋白受體體：iutA、ireA屬于攝鐵系統(tǒng)；莢膜多糖基因：kpsMII素；分泌的毒素：α-溶血素hly；毒力島基因vaT；HPI核心區(qū)主要結(jié)構(gòu)基因fyuA.有一些研究者認為從腸外組織中分離到的大腸桿菌都可以定為ExPEC，也有些學(xué)者認為當分離到的菌株中含有2個及其以上的毒力基因時，便可認為是ExPEC.本研究中針對11種毒力基因的檢測結(jié)果顯示，vaT、hlyD、iutA、kpsMII、fyuA、ireA、afa的檢出率較高，分別為：70.00%、20.00%、33.33%、23.33%、16.67%、3.33%、3.33%.Zhu等研究發(fā)現(xiàn)從中國分離的64株豬ExPEC的ompA，fimH，vat，traT和iutA非常普遍[10]，其中vat、iutA基因與我們的研究相一致.vaT是1種自轉(zhuǎn)運體液泡毒素，與ExPEC腎臟感染有關(guān)，且在APEC感染禽肺臟和氣囊過程中表達量升高[12-14]；Highland等研究發(fā)現(xiàn)莢膜多糖基因kpsMII在從小貓肺臟分離的ExPEC中有表達[15]；人源致病性ExPEC的fyuA基因檢出率達到65.6%，而犬和貓的致病性ExPEC檢出率高達80%[16-17]；研究發(fā)現(xiàn)APEC的iutA缺失株與野生型相比，致病性明顯降低[18]；其中毒力基因fyuA在UPEC中檢出率高達78%，fyuA突變株的毒力低于野生型[19-20].小鼠的致病性試驗結(jié)果顯示，致病能力最強的菌株均含有毒力基因iutA、fyuA以及毒力基因vaT，其中fyuA、vaT是毒力島基因.馬增軍等[21]報道在分離到的豬源ExPEC中，檢測到含有毒力基因ler、astA、irp2、fyuA和iutA的菌株中，同時含有iutA、fyuA基因，且毒力島基因ler的菌株致病力最強，本試驗的研究結(jié)果顯示，同時含有ireA、fyuA、vaT基因的菌株致病能力也很強.

本試驗分離到的豬源ExPEC菌株，某些菌株的抗生素的耐藥情況非常嚴重，豬源ExPEC對多西環(huán)素的耐藥率可高達100%，這一結(jié)論與王斌等[22]的報道相吻合，對氨芐西林、復(fù)方新諾明的耐藥率也高達90%以上，這與何瑩等[23]的報道基本吻合.試驗發(fā)現(xiàn)多粘菌素B對豬源ExPEC具有較好的抑菌效果，且豬源ExPEC對頭孢吡肟較為敏感，但對頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢唑林等頭孢類藥物敏感性次之，這與張青嫻[24]的報道有所差異.2009年四川省規(guī)?；B(yǎng)殖場豬源大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林、復(fù)方新諾明的耐藥率分別為100.00%、100.00%、96.09%，本試驗分離的30株豬源ExPEC對氨芐西林的耐藥率達到了100%，對阿莫西林以及復(fù)方新諾明的耐藥率也分別達到了93.3%、90.0%；為了調(diào)查豬源ExPEC的耐藥性，張青嫻、徐引娣等在2016～2017年間分離了59株ExPEC，并對20種常用抗生素進行了藥物敏感試驗，其研究結(jié)果顯示：對復(fù)方新諾明的耐藥率高達100%，對利福平、鏈霉素、慶大霉素的耐藥率也高達80%以上，本試驗的藥敏結(jié)果為，利福平、鏈霉素、慶大霉素的耐藥率分別為100%、53.33%、76.67%.米諾環(huán)素、磷霉素對ExPEC具有較好的抑菌效果，但有些個別菌株對米諾環(huán)素、磷霉素不敏感，氨基糖苷類除大觀霉素外，其余藥物對腸外致病性大腸桿菌的抑菌效果都不明顯，對磺胺類、林可胺類以及四環(huán)素類等抗生素也都呈現(xiàn)了不同程度的耐藥性，且大部分菌株都呈現(xiàn)了10重以上的耐藥，且大都表現(xiàn)為多重耐藥.大多數(shù)抗生素對豬源ExPEC已經(jīng)不起作用，或者作用不大，呈現(xiàn)嚴重的耐藥性，因此，在臨床治療時對抗生素的選擇一定要慎重，并且要把人用藥與獸用藥物區(qū)分開，盡量避免交叉用藥.在治療疾病的過程中，要針對性用藥，不應(yīng)盲目使用抗生素[25].本試驗進一步說明了豬源ExPEC的耐藥率之高，耐藥譜之廣泛，因此，在臨床生產(chǎn)實踐中，一定要合理用藥，以降低ExPEC的耐藥性.

4 結(jié)論

本研究從臨床病例分離豬源大腸桿菌，經(jīng)鑒定30株為豬源ExPEC，分群鑒定確定主要分布在B1群，耐藥性試驗發(fā)現(xiàn)分離菌株對氨芐西林、林可霉素、多西環(huán)素、利福平、桿菌肽的耐藥率達到100%，毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)主要毒力基因為vaT、iutA、kpsMII、hlyD.致病性試驗中死亡率最高的為Ex-P27分離株，經(jīng)過高通量測序獲得了基因組圖譜.本試驗通過對豬源ExPEC進行的部分生物學(xué)特性和致病性研究，為指導(dǎo)豬源ExPEC的防治與臨床用藥提供依據(jù).