董晶王邦才施航凌仕良史國軍王澤時（指導(dǎo)）

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波市中醫(yī)院 寧波 315010 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)

乳腺癌近年來發(fā)病率呈升高趨勢，且逐漸年輕化[1]，乳腺癌內(nèi)科治療包括化療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等，雖治療方法眾多，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是影響患者長期生存的最不利因素[2]，因此深入了解乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制是提高患者長期生存率的關(guān)鍵。復(fù)方土貝母是我科的經(jīng)驗方，我科將該方聯(lián)合化療應(yīng)用于晚期三陰性乳腺癌及晚期內(nèi)分泌耐藥乳腺癌并開展了臨床試驗，結(jié)果證明對防治乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有良好療效，相關(guān)數(shù)據(jù)已統(tǒng)計并擬發(fā)表。Wnt/βcatenin信號通路是近年來研究的熱門領(lǐng)域[3-4]，研究證實其與肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[5-6]，但對乳腺癌的相關(guān)研究報道較少[7]，本實驗從Wnt/βcatenin信號通路角度研究復(fù)方土貝母抑制乳腺癌細(xì)胞生長的機制，以期為中醫(yī)藥防治乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和實驗動物 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。4～5周齡SPF級BALB/C雌性裸鼠40只，體質(zhì)量18～20g/只，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司 [實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016]。所有動物均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[實驗動物使用許可證號:SYXK（浙）2013-0184]SPF級層流架中，籠具、墊料、飲水、飼料均經(jīng)滅菌處理，飼養(yǎng)和實驗處理按照無菌操作規(guī)范操作，正式實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3d。

1.2 實驗用藥 復(fù)方土貝母原方：土貝母30g，冬凌草 30g，苦參 10g，薏苡仁 30g，黨參 20g，白術(shù) 20g，藥物購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波市中醫(yī)院中藥房，并由醫(yī)院制劑室制取。上述藥物加入10倍藥量的水煎煮2次，時間分別為2、1.5h，合并2次濾液，濃縮至 0.5、1.0、2.0g·mL-1，滅菌后 4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司（批號：1803280506、1712210608、1802040106）；新生牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品（批號：22011-861218030302）；PBS緩沖液購于杭州科易生物技術(shù)有限公司（批號：20180303-0515）；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR染料均購于 TaKaRa公司（批號：AK1401、AK5101、AK9802）；蛋白提取試劑盒購于南京凱基生物公司（批號：20180317）；預(yù)染蛋白marker購于Thermo公司（批號：00580081）；近紅外染料標(biāo)記的二抗購于Li-COR公司（批號：C70426-05）；β-catening一抗購于 Proteintech公司（批號 51067-2-AP）；E-cadherin（4A2）一抗、Vimentin（D21H3）均購于 CST 公司（批號：13、3）。

1.4 主要儀器設(shè)備 Forma 3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱購于Thermo公司；Axiovert 200型熒光倒置顯微鏡為德國蔡司公司產(chǎn)品；FRESCO 17型冷凍高速離心機購于Thermo scientific公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；NanoDrop 2000微量核酸測定儀購于Thermo公司；Odyssey Clx近紅外雙色激光成像系統(tǒng)為美國LI-COR公司產(chǎn)品。

1.5 方法

1.5.1 建立裸鼠MCF-7移植瘤模型 MCF-7細(xì)胞株以DMEM高糖培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，隔天換液。傳代3次后，將對數(shù)生長期的細(xì)胞以胰蛋白酶消化，PBS洗滌后制成1×107/mL單細(xì)胞懸液，無菌條件下接種于40只雌性BALB/C裸鼠背部皮下，接種劑量0.2mL/只。

1.5.2 實驗分組及給藥 將造模后的BALB/C裸鼠隨機分為4組，即荷瘤對照組、復(fù)方土貝母低、中、高劑量組。所有小鼠均從造模當(dāng)天開始連續(xù)灌胃30d，荷瘤對照組每天以0.9%氯化鈉溶液灌胃，復(fù)方土貝母各劑量組予相應(yīng)濃度復(fù)方土貝母灌胃。灌胃容積均為0.6mL/20g。人與20g小鼠等效劑量換算系數(shù)取0.0026，即低、中、高劑量組分別相當(dāng)于人的等效劑量的 1、2、4 倍[8]，具體劑量為 0.5、1.0、2.0g·mL-1。

1.5.3 移植瘤體積及抑瘤率的測算 所有裸鼠第30天以頸椎脫臼法處死，完整剝?nèi)×鲶w。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑（D）和垂直方向的最大橫徑（d），通過公式計算移植瘤體積，移植瘤體積 V（mm3）=d2×D/2[9]。抑瘤率=（荷瘤對照組平均移植瘤體積－土貝母各劑量組平均移植瘤體積）/荷瘤對照組平均移植瘤體積×100%。

1.5.4 實時熒光定量PCR檢測瘤體β-catenin、E-cadherin、Vimentin的mRNA表達 將各組瘤體組織碾磨勻漿，RNA提取試劑提取總RNA后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用ABI 7500 Fast PCR儀進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性：95℃30s；PCR 反應(yīng)：83.6℃ 5s，83.75℃ 30s，共 40 個循環(huán)。采用GAPDH作為內(nèi)參，以荷瘤對照組作為基準(zhǔn)，根據(jù)2-△△Ct法計算獲得各組基因相對表達量。引物購自美國invitrogen公司。序列見表1。

1.5.5 Western blot檢測瘤體 β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達 將各組瘤體組織碾磨勻漿，提取總蛋白，以Bradford法檢測蛋白濃度，行聚丙烯酰胺凝膠電泳（80V 20min，120V 90min），200mA 電轉(zhuǎn)膜2h，一抗、二抗孵育后，使用ECL發(fā)光液顯色，X線定影后，對膠片進行掃描，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析目的蛋白條帶及β-actin內(nèi)參條帶的平均光密度值，以兩者比值代表蛋白的相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.6 免疫組化檢測瘤體β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達 將瘤體組織取材、固定、脫水、浸蠟、包埋、切片后，將切片于60℃烤片2h，二甲苯脫蠟，100%、95%、80%梯度乙醇脫水。在切片上滴加3%的H2O2避光孵育20min，PBS洗滌3次。切片上滴加一抗，37℃孵育60min，棄去一抗，PBS洗滌5min×3次。滴加二抗，室溫孵育2h后棄去二抗。PBS漂洗后，DAB顯色1～2min，復(fù)染、透明后封片。共40張切片，每張切片選擇代表性的區(qū)域，在400倍視野下觀察拍照，共計5個視野，采用半定量法判定蛋白表達等級并取其平均值。即分別對鏡下陽性細(xì)胞的百分比和染色強度評分。陽性細(xì)胞百分比：0%計為0分，1%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，76%～100%計為4分；染色強度：無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。兩者計分相乘即為表達等級：0～4分為低表達，5～12分為高表達。計算各組高表達和低表達比例。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，多樣本均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，采用 LSD-t法；方差不齊時采用 Dunnettt’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠移植瘤體積及抑瘤率比較 MCF-7細(xì)胞接種后的第6天，小鼠背部皮下可以觸摸到移植瘤體，實驗過程中見復(fù)方土貝母中、高劑量組裸鼠移植瘤體生長相對緩慢。給藥30d后，復(fù)方土貝母中、高劑量組平均移植瘤體積小于荷瘤對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低劑量組平均移植瘤體積也小于荷瘤對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），高劑量組平均移植瘤體積與中劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。中、高劑量組抑瘤率高于低劑量組。見表2。

2.2 各組小鼠瘤組織中 β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較 復(fù)方土貝母低、中、高劑量組β-catenin、Vimentin mRNA相對表達量較荷瘤對照組顯著降低，E-cadherin mRNA相對表達量較荷瘤對照組顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。復(fù)方土貝母各劑量組間比較，3種mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 各組小鼠移植瘤體積和抑瘤率比較（±s）Tab.2 Comparison of the tumor volumes and inhibition rates in each group(±s)

表2 各組小鼠移植瘤體積和抑瘤率比較（±s）Tab.2 Comparison of the tumor volumes and inhibition rates in each group(±s)

注：與荷瘤對照組比較，*P＜0.05Note:Compared with tumor control group,*P＜0.05

組別 n 移植瘤體積（mm3） 抑瘤率（%）復(fù)方土貝母低劑量組復(fù)方土貝母中劑量組復(fù)方土貝母高劑量組荷瘤對照組10 10 10 10 2 993.97±1 408.36 2 106.79±799.47*2 237.25±1 002.86*3 347.49±1 443.22 10.56 37.06 33.17-

2.3 各組小鼠瘤組織中 β-catenin、E-cadherin、Vi－mentin蛋白表達比較 復(fù)方土貝母中、高劑量組βcatenin、Vimentin蛋白表達量低于荷瘤對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示該組瘤組織中β-catenin、Vimentin蛋白表達減弱；低劑量組β-catenin、Vimentin蛋白表達量與荷瘤對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。復(fù)方土貝母中、高劑量組E-cadherin蛋白表達量高于荷瘤對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示該組瘤組織中E-cadherin蛋白表達增強；低劑量組E-cadherin蛋白表達量與荷瘤對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。中、高劑量組間比較，3種蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 4、圖 1。

2.4 各組小鼠瘤體β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達 荷瘤對照組β-catenin高表達比例100%，復(fù)方土貝母低劑量組高表達比例為90%，中劑量組為50%，高劑量組為40%。與荷瘤對照組比較，復(fù)方土貝母中、高劑量組β-catenin高表達比例明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而低劑量組高表達比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。荷瘤對照組E-cadherin高表達比例10%，復(fù)方土貝母低劑量組高表達比例為30%，中劑量組為80%，高劑量組為90%。與荷瘤對照組比較，復(fù)方土貝母中、高劑量組E-cadherin高表達比例明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而低劑量組高表達比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。荷瘤對照組Vimentin高表達比例100%，復(fù)方土貝母低劑量組高表達比例為80%，中劑量組為30%，高劑量組為20%。與荷瘤對照組比較，復(fù)方土貝母中、高劑量組Vimentin高表達比例明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而低劑量組高表達比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2-4。

表3 各組小鼠瘤組織β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較（±s）Tab.3 Comparison of relative expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin mRNA in each group（±s）

表3 各組小鼠瘤組織β-catenin、E-cadherin、Vimentin mRNA相對表達量比較（±s）Tab.3 Comparison of relative expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin mRNA in each group（±s）

注：與荷瘤對照組比較，*P＜0.05Note:Compared with tumor control group,*P＜0.05

組別 n β-catenin E-cadherin Vimentin復(fù)方土貝母低劑量組復(fù)方土貝母中劑量組復(fù)方土貝母高劑量組荷瘤對照組0.64±0.02*0.45±0.04*0.37±0.05*1.00±0.15 10 10 10 10 0.71±0.12*0.53±0.06*0.48±0.03*1.00±0.14 1.44±0.01*1.78±0.03*1.93±0.02*1.00±0.12

表4 各組小鼠瘤組織中β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin protein in each group（±s）

表4 各組小鼠瘤組織中β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin protein in each group（±s）

注：與荷瘤對照組比較，*P＜0.05Note:Compared with tumor control group,*P＜0.05

組別 n β-catenin E-cadherin Vimentin復(fù)方土貝母低劑量組復(fù)方土貝母中劑量組復(fù)方土貝母高劑量組荷瘤對照組3.662±2.729 1.789±0.791*1.855±0.752*3.127±1.176 10 10 10 10 0.215±0.017 0.189±0.028*0.167±0.023*0.248±0.046 0.014±0.010 0.029±0.011*0.032±0.021*0.015±0.012

圖1 各組小鼠瘤組織中β-catenin、E-cadherin、Vimentin蛋白表達比較Fig.1 Comparison of expression of β-catenin,E-cadherin,Vimentin protein in each group

圖2 各組小鼠瘤體中β-catenin蛋白的表達（400×）Fig.2 Expression of β-catenin protein in each group(400×)

圖3 各組小鼠瘤體中E-cadherin蛋白的表達（400×）Fig.3 Expression of E-cadherin protein in each group(400×)

圖4 各組瘤體中Vimentin蛋白的表達（400×）Fig.4 Expression of Vimentin protein in each group(400×)

3 討論

乳腺癌屬于中醫(yī)學(xué)“乳巖”“乳石癰”范疇?！吨T病源候論·石癰候》云:“有下于乳者，其經(jīng)虛，為風(fēng)寒阿氣客之，則血澀結(jié)成癰腫，但結(jié)核如石，謂之石癰?！盵10]《外科正宗》云：“憂郁傷肝，思慮傷脾，積想在心，所愿不得者，致經(jīng)絡(luò)痞澀，聚結(jié)成核?！盵11]說明在正氣不足的情況下，外邪可客于乳絡(luò)，或由于情志內(nèi)傷導(dǎo)致肝郁脾虛、氣滯痰凝、邪毒內(nèi)蘊而發(fā)病，因此，“扶正祛邪”法應(yīng)貫穿乳腺癌治療的始終。復(fù)方土貝母是我院腫瘤科治療乳腺癌的經(jīng)驗方，由土貝母、冬凌草、苦參、薏苡仁、黨參、白術(shù)組成，其中土貝母、冬凌草化痰解毒抗癌為君，苦參、薏苡仁清熱利濕為臣，黨參、白術(shù)健脾益氣為佐，諸藥配伍緊扣“健脾益氣、化痰解毒”的中醫(yī)治則。該方中土貝母皂苷具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用[12]；冬凌草甲素能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低端粒酶活性，抑制腫瘤細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成等[13]，還能下調(diào) MCF-7 細(xì)胞 Wnt4、GSK3β、βcatenin表達量[14]；苦參堿能干擾細(xì)胞周期，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和VEGFR-2表達[15]；薏苡仁中多糖葡聚糖混合物及酸性多糖Ⅱa-1、2、3，Ⅱb部分均顯示抗補體活性[16]1285；黨參、白術(shù)有增強體液、細(xì)胞免疫功能，提高巨噬細(xì)胞吞噬能力及自然殺傷細(xì)胞活性[16]1031,447。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]，該過程能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞化[18]，引起腫瘤化療抵抗[19]。EMT主要分子特征有細(xì)胞上皮表型如E-cadherin、密封蛋白（occludin）表達下降或缺失，間質(zhì)表型如Vimentin、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）表達增強[20]。研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)穩(wěn)定，其缺失是上皮腫瘤細(xì)胞侵襲的前提條件；E-cadherin表達降低引起細(xì)胞間粘附性下降，繼而細(xì)胞脫落擴散，造成腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。Vimentin存在于間充質(zhì)細(xì)胞中，作為細(xì)胞骨架支撐維持細(xì)胞形態(tài)，在腫瘤細(xì)胞遷移黏附中發(fā)揮作用[20]。

Wnt/β-catenin信號通路是EMT最主要誘因之一[21]。此通路中β-catenin是關(guān)鍵蛋白，其表達增加可抑制E-cadherin表達，增加Vimentin表達，最終介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT[20]。當(dāng)β-catenin積累到一定水平后可直接進入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞生長因子 4（T cell factor4，TCF4）/淋巴增強因子（lymphoid enhancer-binding factors，LEFs） 結(jié) 合 ， 激 活 下 游CD44、c-myc、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1等基因表達和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[20-21]。有研究證實，中藥可影響Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)蛋白的表達[22]。

本研究結(jié)果表明，復(fù)方土貝母中、高劑量組移植瘤體積小于荷瘤對照組。各劑量組瘤體中β-catenin、Vimentin mRNA表達也低于荷瘤對照組，E-cadherin mRNA表達高于荷瘤對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，證明復(fù)方土貝母各劑量組均能抑制β-catenin、Vimentin mRNA表達，促進E-cadherin mRNA表達。中、高劑量組E-cadherin蛋白表達高于荷瘤對照組，而β-catenin、Vimentin蛋白表達低于荷瘤對照組，證明中、高劑量組上調(diào)了E-cadherin蛋白表達，下調(diào)了β-catenin、Vimentin蛋白表達。分子層面微觀結(jié)果符合宏觀所見抑瘤效果，提示復(fù)方土貝母能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路而抑制腫瘤增殖。值得注意的是，復(fù)方土貝母低劑量組β-catenin、Vimentin mRNA表達低于荷瘤對照組，E-cadherin的mRNA表達高于荷瘤對照組，而三者蛋白表達與荷瘤對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，可能由于實驗方法對mRNA含量敏感度更高所致。關(guān)于復(fù)方土貝母濃度與療效的相關(guān)性，尚需進一步臨床實驗證實。

本研究為復(fù)方土貝母的臨床應(yīng)用提供了一定的實驗基礎(chǔ)，不足之處在于實驗動物數(shù)量較少，在后續(xù)研究中將擴大樣本量，并進一步行體外實驗印證結(jié)果；在臨床研究方面，擬與化療藥物聯(lián)用，從更多角度評價其療效。