霍夢(mèng)恩，李冬利，羅小燕，安 然，文 帥，賴幸菲，孫世利*

（1.五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院，廣東江門 529020；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；3.廣東中藝職業(yè)培訓(xùn)學(xué)院，廣東廣州 510520）

茶對(duì)人體具有廣泛的益處[1]，且具有獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)，深受人們喜愛。茶葉經(jīng)過合理的儲(chǔ)存與陳化，其感官品質(zhì)與內(nèi)含成分與新茶相比有質(zhì)的變化[2-3]。近年來，有關(guān)陳年茶的研究主要集中在黑茶和綠茶，且主要研究其感官品質(zhì)和生化成分變化[4-10]。有關(guān)陳年烏龍茶的生化成分及其體外抗氧化活性等的研究少有報(bào)道。本文以三個(gè)茶樹品種的1990年和2016年的烏龍茶為研究對(duì)象，分別測定和比較分析其生化成分含量及其體外抗氧化與抑制α-淀粉酶和胰脂肪酶的活性，同時(shí)采用灰度關(guān)聯(lián)分析法分析其生化成分與抗氧化活性、抑制α-淀粉酶和胰脂肪酶的活性關(guān)聯(lián)度，以期為陳年烏龍茶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

1990年和2016年的黃金桂、嶺頭單叢和大葉奇蘭烏龍茶，茶樣密封后置于干燥、無異味、陰涼處保存。

1.1.2 試劑

沒食子酸（GA）、兒茶素（C）、沒食子兒茶素（GC）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）均購自Sigma公司?？Х葔A（CAF）購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：德國Merck公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；ZMQS5001型Millipore純水儀，密理博（Millipore）公司；HHS型恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；OHAUS準(zhǔn)微量電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；752N紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 主要生化成分測定

水分測定：GB 5009.3-2016；水浸出物含量測定：GB/T8305-2013；茶多酚含量測定：GB/T 8313-2018；氨基酸含量測定：GB/T 8314-2013；可溶性糖含量測定：蒽酮-硫酸比色法。

1.3.2 兒茶素、沒食子酸和咖啡堿測定

茶湯浸提：準(zhǔn)確稱取各茶葉磨碎樣1.5 g，置于三角燒瓶中，加入沸騰的蒸餾水225 mL，置于沸水浴鍋中浸提45 min，中間攪拌2～3次，浸提完畢后趁熱抽濾，濾液轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，冷卻后加蒸餾水定容。

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，150 mm×4.6 mm；檢測波長280 nm，檢測溫度28℃；流動(dòng)相A：含0.5%乙酸、1%乙腈和2%甲醇的水溶液；流動(dòng)相B：含0.5%乙酸、10%乙腈和20%甲醇的水溶液；洗脫步驟：在30 min內(nèi)，A相由72.5%到20%，B相由27.5%到80%，30 min后在5 min內(nèi)，A相由20%恢復(fù)到72.5%，B相由80%恢復(fù)到27.5%，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為 10 μL，（B相由 80%到27.5%之后，一直持續(xù)到40 min）。以外標(biāo)法按峰面積進(jìn)行定量。

1.3.3 體外活性測定

茶葉水浸提物的制備：稱取適量的陳年烏龍茶按茶水比1:20在90℃下浸提0.5 h，然后趁熱過濾并收集濾液，重復(fù)三次。對(duì)收集的濾液進(jìn)行旋蒸濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥得到烏龍茶浸提物的凍干粉，干燥保存。

茶葉的總抗氧化能力測定：采用FRAP法，具體操作步驟參考向麗敏等[4]的方法。

體外抑制α-淀粉酶活性的測定：取0.3 mL α-淀粉酶液于試管中，分別加入0.3 mL不同稀釋倍數(shù)的待測樣品，混勻后放入37℃恒溫水浴鍋中水浴8 min，然后加入0.3 mL預(yù)熱至37℃的1%可溶性淀粉，37℃水浴反應(yīng)10 min后加入0.3 mL DNS顯色劑，混勻后沸水浴反應(yīng)5 min，流水沖洗冷卻至室溫，最后用適量的水稀釋到一定體積，于540 nm下測吸光值[11-13]。

體外抑制胰脂肪酶活性的測定：取3 mL茶樣和1 mL酶溶液于試管中，混勻后放入37℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，然后加入1 mL橄欖油，再放入溫水浴中震蕩水浴10 min，再加2 mL苯，繼續(xù)反應(yīng)2 min，終止反應(yīng)。取上層有機(jī)相于新的離心管中，加1 mL顯色劑渦旋振蕩3 min，取用上層含有脂肪酸銅的苯溶液，用相同方法制備不含胰脂肪酶的空白溶液為對(duì)照，在710 nm波長下測其吸光度[14-15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±SEM）表示，試驗(yàn)處理重復(fù)3次，使用GraphPad Prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，以2016年烏龍茶為對(duì)照進(jìn)行t-test分析，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要常規(guī)生化成分

從表1中可以看出，黃金桂品種1990年的烏龍茶的水浸出物、茶多酚、氨基酸、可溶性糖和黃酮類含量均較2016年的烏龍茶低，其中氨基酸、可溶性糖和黃酮類的含量差異達(dá)到極顯著差異；嶺頭單叢品種的烏龍茶茶多酚和氨基酸含量1990年極顯著低于2016年，而可溶性糖、水浸出物和黃酮類的含量1990年高于2016年，其中可溶性糖的含量達(dá)到極顯著差異；大葉奇蘭品種的烏龍茶的茶多酚、氨基酸、可溶性糖和黃酮類含量1990年分別較2016年低，其中氨基酸和黃酮類的含量差異達(dá)到極顯著水平，水浸出物含量則較2016年高，且達(dá)到極顯著差異。這些可能與茶樹品種和鮮葉原料老嫩程度不一及年份不同有關(guān)。

表1 陳年烏龍茶的生化成分含量 （%）Table 1 Contents of biochemical components in aged oolong teas （%）

2.2 兒茶素

從表2結(jié)果可知，三個(gè)品種陳年烏龍茶中GC、EGC、EC、EGCG和ECG的含量均為1990年比2016年的低，除兒茶素GC外，均達(dá)到顯著或極顯著差異水平；而酯型兒茶素、非酯型兒茶素和兒茶素總量也均表現(xiàn)為1990年比2016年低，且都達(dá)到極顯著差異水平。

2.3 沒食子酸與咖啡堿

三個(gè)品種1990年的烏龍茶的GA含量均比2016年的高，且達(dá)到極顯著性差異。而1990年的黃金桂和大葉奇蘭的烏龍茶的CAF含量均比2016年的高，達(dá)到極顯著性差異；而1990年的嶺頭單叢的CAF的含量則比2016年低（表3）。

2.4 抗氧化能力

三個(gè)品種兩個(gè)年度的烏龍茶體外總抗氧化能力的結(jié)果表明，嶺頭單叢烏龍茶和大葉奇蘭烏龍茶的總抗氧化能力均表現(xiàn)為2016年的烏龍茶高于1990年的烏龍茶；兩個(gè)年份的黃金桂烏龍茶的總抗氧化能力差別不大（圖1）。

2.5 抑制α-淀粉酶活性

從圖2可看出，1990年和2016年的烏龍茶均具有體外抑制α-淀粉酶活性，并表現(xiàn)出劑量依賴性。從表4結(jié)果來看，2016年的烏龍茶抑制α-淀粉酶的IC50值均小于1990年的烏龍茶，可見，兩個(gè)茶樹品種烏龍茶的抑制α-淀粉酶的活性2016年的茶均比1990年的茶高。

2.6 抑制胰脂肪酶活性

從圖3中可看出，1990年和2016年的烏龍茶均具有體外抑制胰脂肪酶活性，且具有劑量依賴性。從表5可知，2016年的烏龍茶抑制胰脂肪酶的IC50值均小于1990年的烏龍茶，可見，兩個(gè)茶樹品種2016年的烏龍茶抑制胰脂肪酶的活性均比1990年的高。

表2 陳年烏龍茶的兒茶素含量 （mg/g）Table 2 Contents of catechins in aged oolong teas （mg/g）

表3 陳年烏龍茶的沒食子酸與咖啡堿含量 （mg/g）Table 3 Contents of gallic acid and caffeine in aged oolong teas （mg/g）

圖1 陳年烏龍茶總抗氧化能力Fig.1 Comparison of total antioxidant capacity of aged oolong teas stored in different years

圖2 陳年烏龍茶抑制α-淀粉酶活性Fig.2 Comparison of the inhibition of α-amylase activity by aged oolong teas stored in different years

圖3 陳年烏龍茶抑制胰脂肪酶活性的比較Fig.3 Comparison of the inhibition of pancreatic lipase activity by aged oolong teas stored in different years

2.7 陳年烏龍茶的生化成分與活性的灰色關(guān)聯(lián)性

2.7.1 主要生化成分與總抗氧化能力

表4 抑制α-淀粉酶活性的IC50值Table 4 IC50 value of inhibiting α-amylase activity

表5 抑制胰脂肪酶活性的IC50值Table 5 IC50 value of aged oolong teas in inhibiting pancreatic lipase

以300 μg/mL的茶湯的FRAP值為參考序列，其余生化成分含量為比較序列，計(jì)算得到各個(gè)序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)：茶多酚=0.6292；可溶性糖=0.6057；黃酮類=0.4631；氨基酸=0.3875；總兒茶素=0.3364；咖啡堿=0.3148；沒食子酸=0.2689。關(guān)聯(lián)度排列順序?yàn)椋翰瓒喾樱究扇苄蕴牵军S酮類＞氨基酸＞總兒茶素＞咖啡堿＞沒食子酸。表明對(duì)陳年烏龍茶的總抗氧化能力影響最大的生化成分是茶多酚，其次是可溶性糖，影響最小的是沒食子酸。

2.7.2 主要生化成分與抑制α-淀粉酶活性

以IC50值為參考序列，其余生化成分含量為比較序列，計(jì)算得到各個(gè)序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)：茶多酚=0.3136；可溶性糖 =0.2781；黃酮類=0.2587；咖啡堿=0.2433；沒食子酸=0.2148；氨基酸=0.2000；總兒茶素=0.1535。關(guān)聯(lián)度排列順序?yàn)椋翰瓒喾樱究扇苄蕴牵军S酮類＞咖啡堿＞沒食子酸＞氨基酸＞總兒茶素。表明對(duì)陳年烏龍茶抑制α-淀粉酶活性影響最大的生化成分是茶多酚，其次是可溶性糖，影響最小的是總兒茶素。

2.7.3 主要生化成分與抑制胰脂肪酶活性

以IC50值為參考序列，其余生化成分含量為比較序列，計(jì)算得到各個(gè)序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)：可溶性糖=0.4715；茶多酚=0.4396；氨基酸=0.3680；黃酮類=0.3705；咖啡堿=0.3427；總兒茶素=0.3078；沒食子酸=0.2240。關(guān)聯(lián)度排列順序?yàn)椋嚎扇苄蕴牵静瓒喾樱景被幔军S酮類＞咖啡堿＞總兒茶素＞沒食子酸。表明對(duì)陳年烏龍茶抑制胰脂肪酶活性影響最大的生化成分是可溶性糖，其次是茶多酚，影響最小的是沒食子酸。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)三個(gè)品種茶樹不同年份的烏龍茶的茶多酚、兒茶素、氨基酸、可溶性糖等生化成分含量進(jìn)行測定分析，三個(gè)品種烏龍茶的茶多酚、兒茶素和氨基酸含量均表現(xiàn)為2016年比1990年的高，沒食子酸的含量則相反。有研究表明，綠茶與鐵觀音的茶多酚、兒茶素和游離氨基酸含量均隨貯藏年份的增加而降低，而沒食子酸的含量會(huì)增加[9-10,16]，這與本研究的結(jié)果一致。還有研究表明，鐵觀音和單叢的水浸出物含量隨貯存時(shí)間的延長呈下降趨勢，可溶性糖的含量變化則有降低也有增加[16-17]，本研究結(jié)果顯示三個(gè)品種不同年份的烏龍茶的水浸出物和可溶性糖的含量變化沒有明顯規(guī)律，還有待進(jìn)一步的研究。

嶺頭單叢和大葉奇蘭烏龍茶體外抗氧化能力表現(xiàn)為2016年的比1990年的高，黃金桂烏龍茶則差別不大。灰度關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明茶多酚對(duì)陳年烏龍茶的總抗氧化能力貢獻(xiàn)最大，這與三個(gè)品種烏龍茶的茶多酚含量水平與抗氧化能力活性間關(guān)系相符合。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，茶多酚中的主要成分兒茶素對(duì)總抗氧化能力的關(guān)聯(lián)度較低，這可能與茶多酚中的其它多酚類物質(zhì)，如黃酮醇類、花青素、酚酸及縮酚酸等同樣具有重要的抗氧化能力有關(guān)[18-22]。

三個(gè)品種的烏龍茶體外抑制α-淀粉酶和胰脂肪酶活性均表現(xiàn)為2016年的比1990年的高。通過灰色關(guān)聯(lián)分析可知茶多酚對(duì)陳年烏龍茶的抑制α-淀粉酶活性貢獻(xiàn)較大，其次是茶多糖；茶多糖對(duì)陳年烏龍茶的抑制胰脂肪酶活性貢獻(xiàn)較大，其次是茶多酚。王林戈等人的研究結(jié)果表明茶多糖和茶多酚在協(xié)同作用時(shí)刺激細(xì)胞分泌胰島素的效果最顯著[23]。李星亞等人的研究結(jié)果表明茶多酚和茶多糖的協(xié)同作用不僅能降低血糖，還能降低甘油三酯和膽固醇的含量，同時(shí)能提高高密度脂蛋白的含量，促進(jìn)了體內(nèi)的糖脂代謝[24-25]。可見，茶多酚和可溶性糖在降血糖和降血脂方面均具有重要的作用。這與三個(gè)茶樹品種的烏龍茶茶多酚和可溶性糖含量2016年比1990年高相符合。