丁浩 安超 薛文嬌

摘要：對分離自野生冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）的一株真菌F4539進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，并對其發(fā)酵產(chǎn)物進行抗氧化活性研究。結果表明，F(xiàn)4539（Genbank號為KU359775）與Hirsutella sinensis（AJ309355）具有99%的相似性，初步確認F4539為中華被毛孢（Hirsutella sinensis）?？寡趸钚栽囼灲Y果表明，F(xiàn)4539發(fā)酵物20 g/L乙醇提取液的DPPH抗氧化活性為75.39%，高于同濃度國產(chǎn)某商品化冬蟲夏草菌菌絲體膠囊乙醇提取物的抗氧化活性，進一步研究表明，F(xiàn)4395發(fā)酵物和國產(chǎn)某商品清除DPPH自由基的IC50分別為5.96 g/L和11.61 g/L，即F4539發(fā)酵提取物清除DPPH自由基的能力強于國產(chǎn)某商品。

關鍵詞：冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）；中華被毛孢（Hirsutella sinensis）；抗氧化

中圖分類號：S567.3+5 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）03-0057-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.03.016 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： A fungus numbered F4539 was isolated from wild Cordyceps sinensis and identified by morphology and molecular biological identification， in addition， the antioxidant activity for the fermentation products were studied. The results demonstrated that F4539（Genbank： KU359775） had relatively high similarity in evolution with Hirsutella sinensis（AJ309355）， it was confirmed that F4539 was Hirsutella sinensis； Antioxidant activity tests showed that the DPPH antioxidant activity was 75.39% with a concentration of 20 g/L ethanol extract from F4539 fermentation products， which was higher than the same concentration of ethanol extracts from the certain commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule. Further research showed that the IC50 of F4539 fermentation products and commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule were 5.96 g/L and 11.61 g/L respectively. It was shown that the antioxidant activity was higher in F4539 fermentation products than the commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule.

Key words： Cordyceps sinensis； Hirsutella sinensis； antioxidant

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）隸屬麥角菌科蟲草屬，是鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲被中華被毛孢（Hirsutella sinensis）寄生后形成的蟲菌復合體，為中國的珍貴中藥材之一，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功效[1]。它分布于中國青藏高原的西藏、青海、四川、甘肅和云南等地以及印度、尼泊爾和不丹等國的部分地區(qū)。主產(chǎn)于西藏的那曲、林芝、昌都地區(qū)，青海的玉樹、果洛州一帶，四川的阿壩州、甘孜州，云南迪慶州德欽、中旬以北一帶以及甘肅省甘南州瑪曲以西等地。由于野生冬蟲夏草分布地區(qū)狹窄、自然寄生率低、對生活環(huán)境條件要求苛刻，所以本身資源比較有限，再加上自然因素（如天氣干旱、氣候變暖等），天然資源日益匱乏。

近年來由于冬蟲夏草主產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境遭到人為破壞，大量盲目不合理采挖致使資源日趨減少，產(chǎn)量逐年下降，導致天然冬蟲夏草的價格昂貴，自20世紀以來，人們開始探索用人工方法培育仿冬蟲夏草。迄今為止，深層發(fā)酵研究已取得了較大的進展，且生產(chǎn)出的替代品（如菌絲體）的成分和藥效也與天然蟲草相似[2]。中華被毛孢已經(jīng)被證實為冬蟲夏草的無性型[3，4]。

由于冬蟲夏草的全人工培養(yǎng)技術尚未成熟，現(xiàn)階段人們采用發(fā)酵冬蟲夏草菌無性型中華被毛孢，通過提取菌絲活性成分替代天然冬蟲夏草的藥用價值，而由于此前關于冬蟲夏草無性型的爭議，導致多數(shù)研究冬蟲夏草菌的發(fā)酵試驗中的菌種不是中華被毛孢。因此，在通過發(fā)酵法生產(chǎn)冬蟲夏草替代品的產(chǎn)業(yè)化前進行菌株的篩選、鑒定及生物活性測定非常重要。本試驗對前期分離自野生冬蟲夏草的一株真菌F4539進行了形態(tài)學和分子生物學鑒定，結果表明其為中華被毛孢，同時研究了其發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌和抗氧化活性，旨在為進一步產(chǎn)業(yè)化的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

F4539菌株，從野生冬蟲夏草中分離選育獲得，在-80℃超低溫冰箱保存。

活化培養(yǎng)基：蔗糖50 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉3 g/L，無水氯化鈣0.3 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈉1.0 g/L，五水硫酸銅0.01 g/L，七水硫酸亞鐵0.01 g/L，四水氯化錳0.01 g/L，二水氯化鋅0.01 g/L，瓊脂16 g/L，pH 5.6～6.0。

種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和不加瓊脂的活化培養(yǎng)基。

指示菌培養(yǎng)基為商品化營養(yǎng)瓊脂（北京澳博星生物科技公司）。

其他試劑：無水乙醇，DPPH（Sigma）。

1.2 儀器與設備

BSA224S萬分之一天平（Sartorious），UB-7型pH測定儀（Sartorious），5804R離心機（Eppendorf），SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇凈安泰），HUA-85型滅菌鍋（HIRAYAMA），ZHWY-2012型恒溫搖床（上海智誠科技有限公司），BX41型顯微鏡（OLYMPUS），Synergy H1型多功能酶標儀（BioTek），Gel DocTM型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD），2720 Thermal cycle型PCR儀（Applied Biosystems）。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與發(fā)酵培養(yǎng) -80 ℃保藏的菌種接種至活化培養(yǎng)基，于18 ℃培養(yǎng)45 d，將活化好的菌種接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中于18 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)20 d，然后按照5%接種量進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度18 ℃，培養(yǎng)時間20 d。

1.3.2 分子生物學鑒定 取培養(yǎng)20 d的種子液，離心獲得菌體，通過液氮研磨后，采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0（Code No. 9765）提取總DNA。PCR選用真菌鑒定常用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4

（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR擴增反應體系（50 μL）為10×Extaq buffer 5 μL，dNTP （800 μmol/L） 4 μL，Primer ITS1 （10 ng/μL） 2 μL，Primer ITS4（10 ng/μL） 2 μL，DNA模板（50 ng/mL） 5 μL，Extaq酶（5 U/μL） 0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，共進行30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min?；厥漳康钠?，測序工作由華大基因（北京）有限公司完成。將所測序列使用MEGA 5.05中的Clustal W功能進行相似序列的比對，同時采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建該菌株的系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 發(fā)酵提取物清除DPPH自由基活力測定

①DPPH溶液的配制。準確稱取20 mg DPPH，用95%乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到濃度為0.2 mmol/L DPPH，避光保存（0～4 ℃）備用；②樣品乙醇提取物準備。準確稱取0.1 g的提取物，加入5 mL 95%乙醇，超聲波提取1 h，8 000 r/min離心取上清液即為樣品乙醇提取物。③DPPH自由基清除率的測定方法。樣品乙醇提物2 mL及0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL加入同一具塞試管中振蕩搖勻30 min后，測定在517 nm波長的吸光值Ai；測定2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液與2 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光值Ac；測定2 mL樣品乙醇提物與2 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光度Aj，重復3次。根據(jù)公式SR=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%計算清除率SR[5]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 所有的檢測都設置3次重復，數(shù)據(jù)通過Origin Pro 8（OriginLab Corporation，Northampton，USA）軟件進行方程擬合。

2 結果與分析

2.1 菌株的菌落及顯微特性

根據(jù)目前的研究報道[6]，結合作者先前的研究，確定該分離菌株的生長溫度為18 ℃。在活化培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，與培養(yǎng)基接觸處的接種體萌生稀疏的菌絲（圖1A），隨后菌落慢慢形成，在培養(yǎng)30 d以后接種體變成黑褐色，菌落開始隆起并生成黃褐色或灰白色褶皺，部分菌落的表面有多糖分泌出來（圖1B）。挑選生長期的該菌株，制片進行觀察，如圖1C和圖1D所示，F(xiàn)4539在固體培養(yǎng)條件下，氣生菌絲由初級菌絲出芽生長形成次級菌絲，菌絲體無色，有隔膜，次級菌絲還可能再次分叉。在次級菌絲的頂端形成分生孢子梗，而后分生孢子梗頂端特化，逐漸生長膨脹形成瓶梗結構，瓶梗結構可經(jīng)基部分裂形成分生孢子。這些特征與冬蟲夏草菌（Cordyceps sinensis）的描述基本一致[7]。

2.2 菌株分子生物學鑒定

對該菌株進行分子生物學鑒定。通過對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測（圖2），推測獲得的序列長度為500～750 bp，基因測序由華大基因（北京）有限公司完成，其所測ITS序列長度為616 bp，并提交GenBank生物數(shù)據(jù)庫，注冊登錄號為KU359775。通過對該序列進行Blast比對，選擇與其相似性高的序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建，如圖3所示。其中，F(xiàn)4539（KU359775）與Ophiocordyceps sinensis voucher HMAS 173835（EU570946）、Hirsutella sinensis L95DBM-1（AJ309355）和Cordyceps sinensis voucher L95D04（RZ）（AJ309354）具有99%的相似性。2005年10月29日，中國菌物學會在北京召開了“冬蟲夏草及其無性型研討會”，確認冬蟲夏草的學名是Cordyceps sinensi （Berk.） sacc.或Ophiocordyceps sinensis，其無性型是中華被毛孢（Hirsutella sinensis），異名有蝙蝠蛾多（被）毛孢（Hirsutella hepiali）、中華束絲孢（Synnematium sinense）。因此可以確定，F(xiàn)4539為冬蟲夏草菌的無性型中華被毛孢（Hirsutella sinensis）。

2.3 冬蟲夏草菌發(fā)酵物的抗氧化活性

對冬蟲夏草菌F4539的發(fā)酵提取物進行抗氧化活性測定，并與國產(chǎn)某商品化冬蟲夏草菌菌絲體膠囊的提取物進行抗氧化活性對比，結果（圖4）表明，冬蟲夏草菌F4539發(fā)酵物20 g/L乙醇提取液的DPPH抗氧化活性為75.39%，明顯高于同濃度國產(chǎn)某商品提取物的抗氧化性的53.51%，這可能與處理工藝不同有關。本試驗在樣品處理過程中使用低溫培養(yǎng)、冷凍干燥，極大地降低了抗氧化活性的損失。到目前為止，對冬蟲夏草的抗氧化活性的研究已有大量的報道，大多數(shù)以野生冬蟲夏草為研究材料，但對無性型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化研究較少[8，9]。

為了進一步比較冬蟲夏草菌F4539發(fā)酵物及國產(chǎn)某商品化冬蟲夏草菌絲體膠囊乙醇提取物濃度與清除DPPH自由基能力的量效關系，以菌絲體20 g/L的乙醇提取物為基準，按照2倍系數(shù)逐級稀釋獲得20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16 g/L的乙醇提取物，測其對DPPH自由基清除率。隨著乙醇提取物濃度的增加，冬蟲夏草菌F4539發(fā)酵物及國產(chǎn)某商品化冬蟲夏草菌絲體膠囊乙醇提取物對DPPH自由基清除率增強，F(xiàn)4539菌絲體提取物和商品化菌絲體膠囊DPPH清除率對濃度的響應曲線如圖5所示，在試驗設計濃度范圍內(nèi)，提取物清除自由基能力與濃度呈明顯的量效關系，其IC50分別為5.96和11.61 g/L，證明F4539發(fā)酵提取物的抗氧化活性優(yōu)于某商業(yè)化產(chǎn)品，具有進一步開發(fā)的潛力。

3 結論

目前，對冬蟲夏草發(fā)酵的研究主要集中在菌株篩選、發(fā)酵優(yōu)化和發(fā)酵產(chǎn)物活性評價及應用幾個方面。其中確定菌株是否為冬蟲夏草無性型中華被毛孢成為最關鍵的問題之一。因此，在對冬蟲夏草的研究之前對菌株進行鑒定是很有必要的，而分子生物學方法是鑒定冬蟲夏草無性型的最有效方法之一。本研究采用形態(tài)學和分子生物學鑒定手段證明菌株F4539（KU359775）為冬蟲夏草菌的無性型中華被毛孢（Hirsutella sinensis）?？寡趸钚栽囼灡砻?，F(xiàn)4539菌絲體提取物和商品化菌絲體膠囊對DPPH清除率與濃度呈明顯的量效關系，其IC50分別為5.96 和11.61 g/L，證明F4539發(fā)酵提取物的抗氧化活性優(yōu)于某商業(yè)化產(chǎn)品。因此，冬蟲夏草菌F4539具有進一步開發(fā)的潛力。

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