裴俊文，孫太振，蔣立峰

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)(鄭州 450008)

胃癌則是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，也是全球第二大癌癥相關(guān)病死原因[1-3]。在我國(guó)各種惡性腫瘤中，胃癌的發(fā)病率和病死率均居第一位，且發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，每年新發(fā)病例40萬(wàn)左右，占世界發(fā)病總例數(shù)的42%，是當(dāng)前危害國(guó)民身體健康的重大疾病之一[4-5]。我國(guó)胃癌早期診斷率較低，大多數(shù)胃癌被診斷時(shí)已為晚期，盡管經(jīng)過(guò)綜合性的治療，其總體預(yù)后仍較差。中醫(yī)藥在改善胃癌等腫瘤患者臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)帶瘤生存以及改善化療毒副作用等方面的作用已逐漸得到公認(rèn)，因此中醫(yī)藥治療胃癌的作用研究意義重大。細(xì)胞增殖和凋亡失衡是腫瘤最明顯的特征，表現(xiàn)為細(xì)胞正常的凋亡程序受到抑制，而增殖能力增強(qiáng)，胃癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制異常密切相關(guān)[6]。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察我科治療胃癌的有效驗(yàn)方益氣化瘀散結(jié)方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖凋亡的影響，并通過(guò)益氣化瘀散結(jié)方干預(yù)后凋亡相關(guān)蛋白Survivin、Bcl-2的表達(dá)變化探討其相關(guān)作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。益氣化瘀散結(jié)方由黨參、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、夏枯草、蟲(chóng)、炙甘草組成。RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清，Hyclone 公司；噻唑蘭(MTT)、二甲基亞砜( DMSO)，0.25%胰酶，Solarbio公司；Survivin、Bcl-2一抗，CST公司；β-actin一抗、牛抗鼠二抗，Santa Cruz公司；RNA提取試劑盒，TIANGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR reen I熒光定量PCR試劑盒，Vazyme公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥誘導(dǎo) SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的CO2孵箱中培養(yǎng)。

3 益氣化瘀散結(jié)方含藥血清制備 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(230±20)g，體重180～220 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為益氣化瘀散結(jié)方組和空白對(duì)照組，各10只。益氣化瘀散結(jié)方給藥劑量按照成人臨床等效劑量換算灌胃，空白對(duì)照組灌胃等量蒸餾水。2次/d，連續(xù)4 d。最后1次灌胃1 h后用水合氯醛麻醉，采用無(wú)抗凝劑真空采血管從腹主動(dòng)脈取血。室溫靜置2 h，3500 rpm 離心20 min，同組分離的血清一塊混勻，經(jīng)恒溫水浴56℃滅活30 min，在超凈臺(tái)用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，分裝，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4 細(xì)胞分組與給藥 培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)用胰酶消化細(xì)胞，按一定濃度種至培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合后用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，將細(xì)胞同步化并隨機(jī)分為四組：空白血清組、5%益氣化瘀散結(jié)方組、10%益氣化瘀散結(jié)方組、20%益氣化瘀散結(jié)方組，培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 SGC-7901細(xì)胞按照每孔5×103/ 孔接種到 96 孔板中，按照不同分組分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后，CCK8法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖率。采用酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定光吸收(OD)值。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 SGC-7901細(xì)胞以5×105/ml濃度種96孔板培養(yǎng)24 h后1700r/min離心，棄培養(yǎng)基加入空白鼠血清及不同濃度的益氣化瘀散結(jié)方含藥血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞懸液100 μl于流式管中加入 5 μl Annexin V/FITC 和 10 μ的PI溶液，混勻后于室溫避光孵育 15 min。用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowjo軟件分析不同濃度含藥血清干預(yù)的SGC-7901細(xì)胞的凋亡率。

7 Western-blot 技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞Survivin、Bcl-2的蛋白表達(dá) 消化收集各組細(xì)胞，PBS 1000轉(zhuǎn)5 min離心，洗滌細(xì)胞2次，用RIPA裂解液(按1%的比例加PMSF)裂解細(xì)胞，10000g離心10 min提取細(xì)胞總蛋白。按照BCA法進(jìn)行蛋白定量，將各蛋白樣品調(diào)整至一致濃度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)取適量蛋白樣品，按照4∶1的比例加入5×SDS上樣緩沖液，混勻后95 ℃加熱3～5 min，使蛋白變性。將變性的蛋白加入制好的SDS凝膠孔中，采用恒壓法進(jìn)行電泳，濃縮膠100 V、分離膠80 V。電泳結(jié)束后，取出凝膠，確定目的條帶的大致位置后，將多余的凝膠切除，裁取比目的凝膠稍大的PVDF膜，甲醇中浸泡5 min，然后按照膠、濾紙、膜的順序，其中膠在負(fù)極(黑的一面)，于4℃環(huán)境下200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜完后取出PVDF膜，于5% 脫脂奶粉中，搖床封閉1～2 h。用封閉液稀釋抗體(Survivin、Bcl-2、β-actin，稀釋比例參考抗體說(shuō)明書(shū))，膜在抗體中4 ℃孵育過(guò)夜。棄一抗，TBST洗膜3次，每次5 min，然后加入稀釋后的二抗于室溫下孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，加ECL發(fā)光液，室溫孵育3～5 min，用Western Blot 掃膜儀采集膜上的蛋白條帶，并分析計(jì)算各條帶的灰度值。

8 Real time PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞Survivin、Bcl-2 mRNA的表達(dá) 根據(jù) Gen Bank 靶基因序列設(shè)計(jì)引物，以 GAPDH 為內(nèi)參，均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。GAPDH序列：上游TCGGAGTCAACGGATTTGGT，下游TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC，產(chǎn)物181bp。Survivin序列：上游AGGACCACCGCATCTCTACA，下游TGTTCCTCTATGGGGTCGTCA，產(chǎn)物187bp。Bcl-2 序列：上游AGGCTGGGATGCCTTTGTGG，下游TTTGTTTGGGGCAGGCATGT，產(chǎn)物167 bp。消化收集各組細(xì)胞，提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄，然后采用SYBR-Green 熒光定量試劑盒，羅氏 480 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀檢測(cè)各組細(xì)胞Survivin、Bcl-2 mRNA表達(dá)，采用 2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

結(jié)果

1 益氣化瘀散結(jié)方含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)表1。與空白組比較，5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清均能不同程度的抑制SGC-7901的增殖，其中以10%、20%含藥血清抑制作用明顯(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)比較，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，益氣化瘀散結(jié)方含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，48h達(dá)到高峰，至72h已經(jīng)下降。

2 益氣化瘀散結(jié)方含藥血清對(duì)SGC-7901 細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清干預(yù)后，SGC-7901細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均有不同程度的增加，與空白對(duì)照組比較以10%、20%含藥血清組差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制率比較(%)

注：與5%含藥血清組比較，△P<0.05

表2 各組細(xì)胞凋亡情況比較(%)

注：與空白血清組比較，△P<0.05；與5%含藥血清組比較，▲P<0.05

3 益氣化瘀散結(jié)方對(duì)SGC-7901細(xì)胞Survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 利用β-actin作為內(nèi)參計(jì)算Survivin、Bcl-2蛋白在各組細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清均能下調(diào)Survivin、Bcl-2蛋白的表達(dá)(P<0.05)；不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組間比較，10%、20%含藥血清組Survivin、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于5%含藥血清組(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

4 益氣化瘀散結(jié)方對(duì)SGC-7901細(xì)胞Survivin、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法分析比較各組細(xì)胞目的基因變化。結(jié)果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、20%益氣化瘀散結(jié)方含藥血清均能下調(diào)Survivin、Bcl-2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清組間比較，10%、20%含藥血清組Survivin、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于5%含藥血清組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 各組細(xì)胞Survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

注：與空白血清組比較，△P<0.05；與5%含藥血清組比較，▲P<0.05

表4 各組細(xì)胞Survivin、Bcl-2 mRNA表達(dá)

注：與空白血清組比較，△P<0.05；與5%含藥血清組比較，▲P<0.05

1:空白血清組；2:5%含藥血清組；3:10%含藥血清組；4:20%含藥血清組

圖1 各組細(xì)胞Survivin、Bcl-2蛋白免疫印跡條帶圖

討論

Survivin、Bcl-2基因是與調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Survivin蛋白歸屬凋亡抑制蛋白( IAP) 家族，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制作用最強(qiáng)的蛋白因子，能夠抑制細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞有絲分裂[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin蛋白在正常終末分化組織細(xì)胞中表達(dá)量極低，但在腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，不僅能夠影響Caspase 激活進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，還參與細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤新生血管形成[8-9]。Bcl-2是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抑制細(xì)胞凋亡的基因，目前已發(fā)現(xiàn)其在胃癌、肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞異常高表達(dá)，是參與腫瘤細(xì)胞凋亡的重要基因[10-11]。

胃癌屬于中醫(yī)學(xué)“噎膈”、“積聚”、“胃脘痛”等范疇，其病因涉及六淫邪氣、飲食不節(jié)等外因和臟腑失調(diào)、稟賦虛弱、七情所傷等內(nèi)因，導(dǎo)致肝失疏泄，胃失和降，久病則脾胃損傷，瘀毒交結(jié)[11-12]。中醫(yī)藥在提高腫瘤患者治療成功率、改善生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等方面效果顯著，受到國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可調(diào)節(jié)胃癌中 Survivin、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。梁國(guó)英研究欣胃顆粒干預(yù)胃癌前病變的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，模型組 Survivin 表達(dá)水平增高，而欣胃顆粒能抑制 Survivin 表達(dá)[13]。柚皮素可增加胃癌 SGC7901 細(xì)胞Bax、cleaved-Caspase-3表達(dá)，減少Bcl-2、 Survivin表達(dá)，從而起到促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用[14]。

益氣化瘀散結(jié)方是根據(jù)胃癌“正氣虧虛為本，瘀毒互結(jié)為標(biāo)”的病機(jī)而組方，方中黨參補(bǔ)中益氣，和胃生津；白術(shù)健脾益氣，燥濕利水；黃芪益氣補(bǔ)中；當(dāng)歸補(bǔ)血活血；川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛；桃仁、紅花活血化瘀；夏枯草消腫散結(jié)；蟲(chóng)破血散結(jié)；甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共同發(fā)揮健脾益氣、化瘀散結(jié)的功效?，F(xiàn)代研究表明，方中黨參、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸等均有抗腫瘤作用，且能提高機(jī)體免疫功能。本研究顯示，與空白血清組比較，不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清尤其是10%、20%濃度組均能不同程度抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖。通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡的觀察發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀散結(jié)方含藥血清尤其是10%、20%濃度組干預(yù)后，SGC-7901細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均有不同程度的增加。通過(guò)Western-blot、Real-time PCR 對(duì)Survivin、Bcl-2基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同濃度益氣化瘀散結(jié)方含藥血清干預(yù)后，Survivin、Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯降低，這提示益氣化瘀散結(jié)方抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用，可能與降低凋亡抑制蛋白Survivin、Bcl-2的表達(dá)相關(guān)。