石拓，劉曉倩，范曉光，陳寧

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

纈氨酸是支鏈氨基酸的一種，可以緩解肝功能衰竭，保護(hù)肝臟，也可以促進(jìn)肌肉蛋白的合成，加快創(chuàng)傷的愈合[1-3]。當(dāng)人體缺乏纈氨酸時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)功能的紊亂，因此它常被用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，在提供營(yíng)養(yǎng)支撐的同時(shí)促進(jìn)機(jī)體損傷的修復(fù)。

目前，纈氨酸主要通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)，谷氨酸棒桿菌則是最常用的生產(chǎn)菌株。目前針對(duì)生產(chǎn)菌株的改造主要集中于2個(gè)方面：一方面是通過(guò)誘變育種結(jié)合適應(yīng)性馴化的方法篩選目的遺傳標(biāo)記[4-6]，例如，ZHANG等通過(guò)多輪次隨機(jī)突變獲得了纈氨酸高產(chǎn)菌株C.glutamicumVWB-1，進(jìn)一步使用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)技術(shù)將突變株與標(biāo)準(zhǔn)株C.glutamicumATCC 13869對(duì)比發(fā)現(xiàn)，突變株中與纈氨酸合成相關(guān)的ilvBN、ilvC、ilvD、ilvE基因，分支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因brnFE表達(dá)水平上調(diào)[7]；另一方面則是根據(jù)纈氨酸代謝合成網(wǎng)絡(luò)途徑，使用代謝工程方法通過(guò)強(qiáng)化前體物的供應(yīng)，解除產(chǎn)物對(duì)關(guān)鍵酶的反饋調(diào)節(jié)，提高關(guān)鍵酶編碼基因轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)輔酶供應(yīng)，弱化代謝副產(chǎn)物合成途徑，阻斷目的產(chǎn)物的攝取和強(qiáng)化目的產(chǎn)物的輸出等方式，提高纈氨酸生產(chǎn)菌株的發(fā)酵水平[8-13]。

除了常規(guī)的改造策略以外，選育溫度敏感突變株是提升谷氨酸棒桿菌氨基酸產(chǎn)量的另一策略，并已經(jīng)普遍應(yīng)用于谷氨酸的生產(chǎn)中[14]。與標(biāo)準(zhǔn)株相比，溫度敏感突變株由于細(xì)胞膜/壁合成相關(guān)基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其在高溫條件下細(xì)胞膜/壁通透性增強(qiáng)，使得細(xì)胞由生長(zhǎng)型狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)酸型狀態(tài)，大幅度增加了谷氨酸向胞外的分泌，進(jìn)而有效解除了谷氨酸的反饋調(diào)節(jié)，提高了谷氨酸合成和積累量[15-17]。但到目前為止，與溫度敏感性狀相關(guān)的分子生物學(xué)解析尚不明確，僅有HIRASAWA等人報(bào)道，ltsA基因的缺失會(huì)導(dǎo)致谷氨酸棒桿菌對(duì)溶菌酶敏感，從而產(chǎn)生溫敏性狀，促進(jìn)谷氨酸合成[18-19]。

我們?cè)谇捌诘难芯恐?，通過(guò)比對(duì)溫度敏感型谷氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicumTCCC 11822[20]和標(biāo)準(zhǔn)株C.glutamicumATCC 13032發(fā)現(xiàn)，參與細(xì)胞壁肽聚糖合成的2個(gè)關(guān)鍵酶基因murA(cgl0352)和murB(cgl0353)[21-22]缺失。為了驗(yàn)證上述基因與溫度敏感性狀的關(guān)聯(lián)，我們?cè)谇捌跇?gòu)建的纈氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicum13032ilvBNXV::cgl1890,ilvBNXV::pqo的基礎(chǔ)上，敲除了murA和murB基因，通過(guò)搖瓶發(fā)酵和5 L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同溫度下重組工程菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸水平，以期為纈氨酸生產(chǎn)菌株的定向改造提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的菌株及質(zhì)粒如表1所示。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，NaCl 2.5，MgSO40.5，KH2PO41，瓊脂粉15。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 3 g/L，酵母粉 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，MnSO42 mg/L，F(xiàn)eSO42 mg/L，VB10.3 mg/L，VH0.2 mg/L。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 80 g/L，酵母粉 15 g/L，蛋白胨 5 g/L，K2HPO44 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO430 mg/L，F(xiàn)eSO430 mg/L，VB10.5 mg/L，VH0.3 mg/L，苯酚紅 2%。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g/L，玉米漿 20 mL/L，豆?jié)?0 mL/L，(NH4)2SO415 g/L, KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO410 mg/L，MnSO410 mg/L，VB120 mg/L，VH15 mg/L，谷氨酸 5 g/L，異亮氨酸 0.1 g/L。

1.3 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)條件：用接種環(huán)劃取保菌管中的菌液置于斜面培養(yǎng)基上，均勻地涂布開(kāi)。將斜面置于32 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14 h。

種子培養(yǎng)條件：用接種環(huán)在生長(zhǎng)良好的斜面上劃取1環(huán)菌落置于含有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于32 ℃搖床上，200 r/min培養(yǎng)8 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件：用移液器吸取3 mL培養(yǎng)成熟的種子培養(yǎng)液，置于含有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中，置于32 ℃搖床，200 r/min培養(yǎng)一定時(shí)間后，提溫至39 ℃，200 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)至32 h。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：按照10%接種量，將0.3 L種子液接入到5 L發(fā)酵罐中，初始裝液量為3 L；罐壓0.05，通風(fēng)量2 L/min，溫度33～39 ℃，初始pH 7.0，發(fā)酵過(guò)程中流加800 g/L的葡萄糖維持菌體生長(zhǎng)所需，同時(shí)流加液氨調(diào)整pH值，發(fā)酵周期36 h。

1.4 重組工程菌株的構(gòu)建方法

由于murA和murB基因在C.glutamicumA30基因組只相隔16 bp，因此我們對(duì)murA和murB基因組合進(jìn)行敲除，所用引物如表2所示?；虻臒o(wú)痕敲除方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[23]。

表2 murA和murB基因敲除所用引物Table 2 Primers for murA and murB gene knockout

1.5 肽聚糖的提取及檢測(cè)

參照文獻(xiàn)方法[24-25]對(duì)谷氨酸棒桿菌細(xì)胞壁肽聚糖進(jìn)行分離提取，方法如下：取發(fā)酵結(jié)束后離心得到的菌體20 g，懸浮于200 mL，10 g/L的三氯乙酸溶液中，75 ℃水浴處理25 min后裂解菌體，去除細(xì)胞壁中磷壁酸成分，冷卻至室溫，離心收集不含磷壁酸的細(xì)胞沉淀；用蒸餾水洗滌沉淀至中性，沉淀按固液比1∶5(質(zhì)量體積比)加入胰蛋白酶磷酸鹽緩沖液(胰蛋白酶3 mg/mL PBS，pH8.0)，置于搖床37 ℃振蕩12 h，離心棄去未溶解于胰蛋白酶的沉淀，上清液離心后得到不含蛋白的細(xì)胞壁沉淀，沉淀用蒸餾水洗滌3次，加入氯仿甲醇混合溶液(V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2)處理6 h，去除脂類物質(zhì)；離心收集沉淀，用無(wú)水乙醇洗滌脫水，自然干燥，得到淺褐色膠質(zhì)物質(zhì)即為肽聚糖提取物。

(1)

1.6 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定方法

發(fā)酵過(guò)程中菌體的生物量采用分光光度計(jì)測(cè)定，以O(shè)D600nm值代表菌體濃度；還原糖采用SBA-40生物傳感儀進(jìn)行測(cè)定；pH值采用梅特勒 pH計(jì)S210K進(jìn)行測(cè)定；產(chǎn)物纈氨酸濃度采用高效液相分析系統(tǒng)測(cè)定，色譜分離條件：Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2，4-二硝基氟苯柱前衍生測(cè)定，乙腈與乙酸鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，柱溫33 ℃，流動(dòng)相流量 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組工程菌株C. glutamicum A301的構(gòu)建

在C.glutamicumA30菌株中同時(shí)敲除murA和murB基因，敲除結(jié)果如圖1所示。

其中，上游同源臂長(zhǎng)為493 bp，下游同源臂長(zhǎng)為517 bp；上下游同源臂重疊片段為1 010 bp；murA和murB基因總長(zhǎng)為3 073 bp。從凝膠電泳的結(jié)果可以看出，murA和murB基因成功敲除，菌株C.glutamicumA301構(gòu)建成功。

M-Marker；1-上游同源臂；2-下游同源臂；3-上下游同源臂重疊片段；4-菌株進(jìn)行單交換后，用murAB-1和murAB-4引物進(jìn)行PCR結(jié)果；5-成功敲除murA和murB基因后，用murAB-1和murAB-4引物進(jìn)行PCR結(jié)果圖1 C. glutamicum A301菌株構(gòu)建過(guò)程凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis for C.glutamicum A301 construction

2.2 不同溫度下C. glutamicum A30和C. glutamicum A301菌株的搖瓶發(fā)酵結(jié)果比對(duì)

為了探究murA和murB敲除后對(duì)纈氨酸產(chǎn)量的影響，對(duì)C.glutamicumA30和C.glutamicumA301菌株進(jìn)行了恒溫(32 ℃)發(fā)酵以及變溫(32～39 ℃)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。從圖2可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度恒定為32 ℃時(shí)，C.glutamicumA301菌株的生長(zhǎng)要強(qiáng)于C.glutamicumA30菌株，但C.glutamicumA301菌株的纈氨酸產(chǎn)量相較于C.glutamicumA30菌株提高了8.5%，達(dá)到14.7 g/L。而當(dāng)發(fā)酵條件為變溫發(fā)酵時(shí)，C.glutamicumA301菌株在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的生物量相較于C.glutamicumA30菌株下降了20%，但其纈氨酸產(chǎn)量提高了45.1%，達(dá)到16.3 g/L。

圖2 不同溫度下C. glutamicum A30與C. glutamicum A301菌株的搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig.2 The shake-flask fermentation results of C. glutamicum A30 and C. glutamicum A301 under different temperature

在谷氨酸棒桿菌中，murA和murB基因分別編碼UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶(UDP-N-acetylglucosamine 1-carboxyvinyltransferase)和UDP-N-烯酰葡糖胺還原酶(UDP-N-acetylenolpyruvoylglucosamine reductase)。上述酶可以作用于UDP-N-乙酰葡糖胺及其類似物的功效基團(tuán)，進(jìn)而參與乙酰胞壁酸和肽聚糖的合成[21-22]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),在溫敏型谷氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicumTCCC 11822中存在murA和murB基因缺失，因此推測(cè)上述兩個(gè)基因可能與溫敏性狀的產(chǎn)生存在關(guān)聯(lián)。由表3可以看出，溫度升高時(shí)C．glutamicumA30菌株細(xì)胞壁肽聚糖含量沒(méi)有明顯變化，但是C.glutamicumA301菌株細(xì)胞壁肽聚糖含量則明顯降低。

表3 C. glutamicum A30和C. glutamicum A301菌株細(xì)胞壁肽聚糖含量Table 3 The cell wall peptidoglycan content of C. glutamicum A30 and C. glutamicum A301

對(duì)比2株菌的恒溫(32 ℃)以及變溫(32～39 ℃)發(fā)酵可以看出，C.glutamicumA30菌株在變溫發(fā)酵時(shí)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，但是產(chǎn)酸量急劇下降。與之相比，C.glutamicumA301菌株在變溫發(fā)酵時(shí)由于基因缺失，在高溫下的細(xì)胞壁合成不夠完整，因此抵御溫度脅迫的能力下降，生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，但是產(chǎn)酸量卻由于產(chǎn)物分泌增強(qiáng)較恒溫發(fā)酵有了一定程度的提高。

2.3 不同溫度條件對(duì)C. glutamicum A301生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響

由于murA和murB基因缺失使得C.glutamicumA301菌株具有了溫度敏感特征，因此考察不同溫度條件對(duì)該菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)C. glutamicum A301菌株搖瓶發(fā)酵纈氨酸的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on the shake-flask fermentation of valine by C. glutamicum A301 strain

從圖3-a可以看出，不同溫度下C.glutamicumA301菌株的生長(zhǎng)速率及生物量均有所不同。當(dāng)發(fā)酵溫度為33 ℃時(shí)，菌體對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率較高，菌體OD達(dá)到最大值60.1，比30 ℃、36 ℃和39 ℃時(shí)分別提高了11.2%、27.1%和72.9%。當(dāng)發(fā)酵溫度為39 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率變緩，菌體OD值僅為34.8。谷氨酸棒桿菌細(xì)胞壁分為內(nèi)外兩層，外層的主要成分是霉菌酸，而內(nèi)層的主要成分是肽聚糖[26]。菌體生長(zhǎng)與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)的原因是由于功能酶的缺失造成高溫條件下肽聚糖合成受到一定干擾，細(xì)胞壁內(nèi)層合成的不完整不至于引發(fā)菌體直接死亡，但卻會(huì)影響菌體的分裂增值，導(dǎo)致生物量下降。

從圖3-b可知，不同溫度下C.glutamicumA301菌株的產(chǎn)物積累量有所不同。當(dāng)發(fā)酵溫度為39 ℃時(shí)，纈氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大值13.8 g/L，比30 ℃、33 ℃和36 ℃時(shí)分別提高了21.4%、5.0%和4.9%。結(jié)合表3的結(jié)果可以推測(cè)，隨著溫度的提升，C.glutamicumA301菌株合成肽聚糖減少，細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)導(dǎo)致產(chǎn)物向胞外的分泌增加，從而刺激細(xì)胞代謝向產(chǎn)物合成的方向流動(dòng)，提升了單個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)酸能力。

2.4 使用C. glutamicum A301菌株分段控溫發(fā)酵生產(chǎn)纈氨酸

溫度對(duì)于C.glutamicumA301菌株的影響是多方面的，發(fā)酵過(guò)程中在保持菌體生物量的同時(shí)要追求纈氨酸產(chǎn)量的提升。從圖4可以看出，在發(fā)酵前期0～15 h產(chǎn)物纈氨酸的合成速率不隨溫度的升高而改變，但菌體生物量卻隨溫度的升高顯著降低。在15h之后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)中后期逐漸趨于平穩(wěn)，但是產(chǎn)物纈氨酸的合成速率卻隨溫度的升高而逐漸增強(qiáng)。因此發(fā)酵過(guò)程中可以采用分段控溫的方法，在發(fā)酵前期保證菌體的正常生長(zhǎng)，而當(dāng)菌體達(dá)到一定生物量后采用提溫的方式增加纈氨酸的產(chǎn)量。

由表4可知，當(dāng)采用分段控溫發(fā)酵時(shí)，菌體OD值與全程33 ℃發(fā)酵相比略有降低，但遠(yuǎn)高于全程39 ℃發(fā)酵。

表4 不同溫度控制策略對(duì)C. glutamicum A301菌株搖瓶發(fā)酵纈氨酸的影響Table 4 Effects of different temperature control strategieson the shake-flask fermentation of valineby C. glutamicum A301 strain

分段控溫發(fā)酵時(shí)纈氨酸產(chǎn)量達(dá)到最高值18.2 g/L，與全程33 ℃和39 ℃發(fā)酵相比分別提高了38.9%和68.5%。同時(shí)，分段控溫發(fā)酵時(shí)纈氨酸轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到19.9%。

在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用同樣的分段控溫策略即前15 h控溫33 ℃，15 h之后提溫至39 ℃，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。分段控溫發(fā)酵時(shí)菌體的最大OD值達(dá)到60.3，與全程33 ℃發(fā)酵相比下降了14.3%；分段控溫發(fā)酵時(shí)纈氨酸產(chǎn)量達(dá)到35.5g/L，與全程33 ℃發(fā)酵相比提高了55.7%。

圖4 不同溫度控制策略對(duì)C. glutamicum A301菌株5 L罐發(fā)酵纈氨酸的影響Fig.4 different temperature control strategies on the fed-batch fermentation of valine by C. glutamicum A301 strain

3 結(jié)論

選育溫度敏感突變株能夠提升谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)氨基酸的能力，但傳統(tǒng)育種方法多為誘變育種。本研究通過(guò)定向敲除murA和murB基因使得纈氨酸生產(chǎn)菌株獲得了一定的溫敏性狀。在變溫發(fā)酵條件下，重組工程菌株的纈氨酸產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比有了明顯的提升。在5 L發(fā)酵罐中采用分段控溫策略發(fā)酵即前15 h控溫33 ℃，15 h之后提溫至39 ℃，重組工程菌株的纈氨酸產(chǎn)量達(dá)到35.5g/L，與全程33 ℃發(fā)酵相比提高了55.7%?？紤]到murA和murB基因與谷氨酸棒桿菌細(xì)胞壁內(nèi)層肽聚糖合成有關(guān)，而上述基因又與溫度敏感性相關(guān)聯(lián)，因此深入理解谷氨酸棒桿菌細(xì)胞壁合成與溫度敏感性狀之間的關(guān)系，將有助于闡明溫度敏感突變株過(guò)量合成氨基酸的分子機(jī)制，同時(shí)也為纈氨酸等氨基酸生產(chǎn)菌株的定向改造提供科學(xué)依據(jù)。