史詠梅，李勇勇，吳迪迪，王焙，張登科，婁永江

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 ，315211)

南美白對蝦(Penaeusvannamei)，又稱凡納濱對蝦，是當今世界除斑節(jié)對蝦和羅氏沼蝦以外的第3大養(yǎng)殖蝦類之一[1]，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、口感柔韌，深受大眾的喜愛[2]。新鮮的南美白對蝦體內(nèi)蛋白質(zhì)和水分含量較高，容易腐爛變質(zhì)。目前我國南美白對蝦的保鮮方式多為凍結(jié)保藏，雖然在低溫狀態(tài)下能抑制微生物和酶活性，但長時間的貯運會使得蝦體干耗、冰晶體膨大，從而引起組織結(jié)構(gòu)變化，且解凍后蝦體汁液流失會降低其自身的鮮度，嚴重影響南美白對蝦的外觀品質(zhì)和食用價值[3]。因此，尋求一種綠色、健康、安全的保鮮方法來維持南美白對蝦的品質(zhì)成為了企業(yè)迫切需要解決的關(guān)鍵問題。

浸漬凍結(jié)是一種凍結(jié)速度快且均勻，耗能低、凍品干耗少的保鮮方式，其凍品冰晶小，解凍后凍品組織的汁液流失率低，對含水量和蛋白質(zhì)含量高的食品品質(zhì)保鮮效果好[4-5]。而靜止空氣凍結(jié)是利用空氣作為凍結(jié)媒介，將食品靜置在低溫下，憑借空氣的自然對流使食品緩慢凍結(jié)的方法[6-7]。CAROLINA等[8]曾將新鮮草莓分別置于-26 ℃冰箱和-20 ℃濃度為2.7 mol/L的CaCl2溶液中進行凍結(jié)處理，結(jié)果顯示：從0 ℃降溫至-10 ℃，浸漬液中的草莓降溫耗時比冰箱凍結(jié)快45 min。NI等[9]曾將草魚魚塊浸漬于由NaCl、C2H5OH、C3H8O2及水配成的浸漬液中凍結(jié)，發(fā)現(xiàn)其凍結(jié)速率是空氣鼓風凍結(jié)的1.5倍，且品質(zhì)變化更小，保鮮效果更好。

本研究選取新鮮的南美白對蝦，通過4種不同凍結(jié)方式(靜止空氣凍結(jié)、液體浸漬凍結(jié)、真空包裝聯(lián)用靜止空氣凍結(jié)和真空包裝聯(lián)用液體浸漬凍結(jié))處理，研究不同凍結(jié)方式對南美白對蝦品質(zhì)的影響，探索適合南美白對蝦的凍結(jié)工藝。

1 材料與方法

南美白對蝦購于浙江寧波象山某海水養(yǎng)殖場，選取體表無損傷，長(12±1) cm，質(zhì)量為(14±2) g，大小均勻的活蝦。

1.1 材料與試劑

乙醇、NaH2PO4、Na2HPO4、L-脯氨酸、兒茶酚、NaOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、丙二醛、三氯甲烷、甲醇、HCl均為分析純(AR)，國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

變頻冰箱(A96FS70TI型)，德國Siemens股份有限公司；自動微量電子分析天平(BM-252型)，日本A&D有限公司；插入式溫度計(905-T1型)，德國TESTO有限公司：色差儀(CR-400型)，日本柯尼卡美能達公司；質(zhì)構(gòu)儀(TMS-PRO)，美國FTC公司；掃描電子顯微鏡(S-3400N型)，日本日立公司；紫外可見分光光度計(UV-1800APC型)，上海美析儀器有限公司；冷凍離心機(Sigma 3k15型)，德國希格瑪公司；均質(zhì)機(Bioprep-24型)，杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理

南美白對蝦購買后放入裝有氧氣和海水的食品袋中，在30 min內(nèi)運回實驗室，立即用海水清洗，用吸水紙擦拭干蝦體表面水分后隨機分成5個組，其中對照組(新鮮活蝦，簡稱CK組)、單一空氣凍結(jié)組(SAF-0)、單一浸漬凍結(jié)組(ICF-0)、真空包裝聯(lián)用空氣凍結(jié)組(SAF-1)、真空包裝聯(lián)用浸漬凍結(jié)組(ICF-1)，每組設(shè)置6個平行。南美白對蝦經(jīng)以上不同方式凍結(jié)后在10 ℃下自然解凍，去頭(部分指標保留蝦頭)、剝殼絞碎后備用。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 中心溫度變化規(guī)律及凍結(jié)速率

將插入式溫度計從蝦頭插入，使得感受器全部包埋入南美白對蝦第2、第3節(jié)腹節(jié)中部，冰水預(yù)冷后凍結(jié)開始，每隔1 min測定并記錄溫度。測量至蝦體溫度達-15 ℃為止，取出溫度計，橫剖蝦測量位置并記錄蝦肉厚度，平行6次。

1.3.2.2 pH值

依據(jù)GB 5009.237—2016食品pH值的測定[10]進行實驗。

1.3.2.3 質(zhì)構(gòu)

將去殼后的南美白對蝦置于物性分析儀平板上，并在對蝦表面隨機選取位置進行測定，探頭選用直徑為3 mm的圓柱形探頭，壓縮探針以1 mm/s速度進行測試，測試型變量為50%[11]，平行6次。

1.3.2.4 肌肉組織表觀

將切蝦肉的工具提前預(yù)冷，待測蝦第2、3腹節(jié)部位切成1 mm×1 mm×1 mm的立方體，放入2 mL圓底離心管，3%戊二醛固定24 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次，每次15 min，用體積分數(shù)為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇各漂洗15 min，無水乙醇漂洗2次，每次10 min，叔丁醇體積分數(shù)為25%的乙醇溶液漂洗10 min，50%叔丁醇的乙醇溶液漂洗10 min，叔丁醇體積分數(shù)75%的乙醇溶液漂洗10 min，純叔丁醇漂洗10 min后吸出上層多余液體，-40 ℃冰箱保存12 h，封口膜封口并戳孔后冷凍干燥24 h，噴金，電鏡觀察[12]，每個樣品平行6次。

1.3.2.5 多酚氧化酶活性(PPO)

在陳閩榕等[13]方法的基礎(chǔ)上，稱取10 g左右待測樣品的蝦頭，于0～4 ℃條件下剪碎研磨，加入20 mL 0.067 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2，預(yù)冷至0 ℃)，勻漿，振蕩混勻，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，所得上清液酶提取液于4 ℃下備用。以0.05 mol/L鄰苯二酚溶液(用濃度為0.1 mol/L、pH 6磷酸緩沖液配制)為PPO的反應(yīng)底物，先置于30 ℃的條件下保溫，然后在具塞離心管中加入2.8 mL底物溶液，再迅速加入0.2 mL酶液，迅速混勻，反應(yīng)1 min，并立即在波長420 nm處測定吸光度，記錄90 s內(nèi)吸光度變化，每30 s記錄1次，測量2 min。酶活力以每分鐘變化0.001吸光度為1個PPO活力單位(U)，平行6次。

1.3.2.6 鹽溶性蛋白含量

在EYMARD[14]方法的基礎(chǔ)上。取2份蝦肉，每份1.00 g，分別加入10 mL高離子磷酸緩沖溶液(0.5 mol/L KCl、0.01 mol/L NaH2PO4、0.03 mol/L Na2HPO4)和10 mL低離子磷酸緩沖液(0.025 mol/L NaH2PO4、0.025 mol/L Na2HPO4)攪拌均勻，前者靜置3 h，后者靜置1 h。然后在3 000 r/min 下離心15 min。取上清液，加入10 mL 15%三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，靜置后加入10 mL 1 mol/L NaOH 溶解蛋白質(zhì)，分別以高、低磷酸鹽緩沖液定容至50 mL，再用雙縮脲試劑法測定蛋白質(zhì)含量。

鹽溶性蛋白含量為高鹽溶液中蛋白質(zhì)含量減去低鹽溶液中蛋白質(zhì)含量，平行6次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

指標數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均值±標準差”的方式表示，使用Microsoft Office Excel 2007及Origin 8.5進行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦中心溫度變化趨勢及凍結(jié)速率的影響

由圖1可知，浸漬凍結(jié)(ICF-0、ICF-1)和空氣凍結(jié)(SAF-0、SAF-1)的凍結(jié)速率呈顯著差異(P<0.05)；無包裝凍結(jié)(ICF-0、SAF-0)和真空包裝凍結(jié)(ICF-1、SAF-1)的凍結(jié)速率呈顯著差異(P<0.05)。同時，由表1可以看出，ICF-0的凍結(jié)速率最快，9 min內(nèi)即可迅速將樣品降溫至-15 ℃，并且-5～0 ℃最大冰晶生成帶耗時僅0.617 min，相比另外3組同階段的凍結(jié)速率差異極顯著(P<0.01)。ICF-1的對蝦在70 min完成凍結(jié)，約為無包裝液體浸漬凍結(jié)組的7.78倍，最大冰晶生成帶耗時13.34 min，約為無包裝組的21.62倍；最大生成帶階段后的凍結(jié)速度先加快再減慢，但相比空氣凍結(jié)組(SAF-0、SAF-1)較快。采用SAF-0的對蝦在第127 min溫度降至-15 ℃，最大冰晶生成帶耗時為45.75 min；-5～-16 ℃階段的凍結(jié)速率先加快再逐步減緩。SAF-1組對蝦凍結(jié)速率最慢，耗時最長為152 min，-5～0 ℃耗時63.93 min，-5 ℃后的凍結(jié)速率總體上趨于平緩。

綜上所述，液體浸漬凍結(jié)組的降溫速率大大快于空氣凍結(jié)組，其中單一浸漬凍結(jié)的降溫速率最快，這可能是由于單一浸漬凍結(jié)的降溫介質(zhì)為液體，相比于空氣，液體的速度更快、能量損失更少。并且，真空包裝對南美白對蝦和介質(zhì)之間有一定的阻隔作用，從而影響對蝦的降溫速率。

SAF-0，單一空氣凍結(jié)組；ICF-0，單一浸漬凍結(jié)組；SAF-1，真空包裝聯(lián)用空氣凍結(jié)組；ICF-1，真空包裝聯(lián)用浸漬凍結(jié)組，下同。圖1 南美白對蝦中心溫度變化趨勢Fig.1 Penaeus vannamei temperature change curve

表1 南美白對蝦在不同凍結(jié)方式下的凍結(jié)時間、最大冰晶生成帶時間和凍結(jié)速率Table 1 The frozen time,maximum ice crystal formationtime and frozen rate of Penaeus vannamei infour different freezing methods

不同凍結(jié)方式凍結(jié)時間/min-5～0 ℃最大冰晶生成帶耗時/min凍結(jié)速率/(cm·h-1)SAF-0127.0045.750.423 4ICF-09.000.6176.896 6SAF-1152.0063.930.313 0ICF-170.0013.341.069 5

注：CK，空白組新鮮活蝦。

2.2 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦pH值的影響

pH值是反映水產(chǎn)品新鮮程度的重要理化指標之一。由圖2可知，新鮮的南美白對蝦pH值為7.4，經(jīng)4種不同凍結(jié)處理的對蝦pH值均有不同程度下降，且兩兩間均具有顯著差異(P<0.05)。其中ICF-0的pH下降幅度較小，僅0.54%，ICF-1次之。而下降幅度最大的是SAF-0組，達到了3.24%。這可能是由于對蝦經(jīng)浸漬凍結(jié)處理后，能在極短的時間內(nèi)使中心溫度降至-15 ℃，從而迅速地減弱了其體內(nèi)的酶活，造成無氧代謝反應(yīng)速度減慢，最終緩解了pH值的下降。

不同字母代表在P<0.05水平上差異顯著。圖2 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦pH值的影響Fig.2 Effect of different freezing methods on the pH of Penaeus vannamei

2.3 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦質(zhì)構(gòu)的影響

硬度是反映南美白對蝦達到一定程度形變所需要的力，南美白對蝦的蛋白質(zhì)含量較高，蝦肉柔軟鮮嫩。隨著凍結(jié)的時間推移，體內(nèi)磷酸精氨酸糖原分解，蝦肌肉中ATP分解并釋放能量，使蝦體溫上升，蛋白質(zhì)酸性凝固和肌肉收縮，從而肌肉失去彈性而變硬[15]。由圖3可知，新鮮蝦在自然死亡后的硬度為2.150 4 kg，而其他4種凍結(jié)方式的硬度大小分別為SAF-0(2.524 4 kg)>SAF-1(2.477 6 kg)>ICF-0(2.297 2 kg)>ICF-1(2.221 5 kg)，由此可見，ICF-1與新鮮蝦體硬度值最為接近，且達顯著性差異(P<0.05)。這可能是因為一方面，真空包裝避免了其活動、損耗的能量較少，南美白對蝦在死亡后體內(nèi)能量不斷分解而減少，推遲其進入僵硬期的時間[16]；另一方面，從圖1可知，液體浸漬凍結(jié)法的凍結(jié)速率快，快速降溫可抑制蝦體內(nèi)、外源蛋白酶的酶促作用，有效控制多種代謝活動，從而起到延長自溶、腐敗時間的作用。

恢復(fù)性反映了南美白對蝦肌肉發(fā)生形變后，恢復(fù)原來狀態(tài)的能力，南美白對蝦在凍結(jié)中構(gòu)成肌肉主要蛋白質(zhì)的肌原纖維蛋白質(zhì)會發(fā)生冷凍變性，表現(xiàn)為鹽溶性降低、ATP酶活性減小、鹽溶液的黏度降低、蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生凝集使空間立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使肌肉持水力降低，缺乏彈性，口感變差[16-17]。如圖3所示，4種凍結(jié)方式處理的南美白對蝦恢復(fù)性均有所下降，分別為SAF-0(0.276 3)

圖3 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦質(zhì)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of different freezing methods on the textureof Penaeus vannamei

新鮮的南美白對蝦彈性值為0.319 4，4種凍結(jié)方式處理的南美白對蝦彈性均有所下降，其中單一空氣凍結(jié)組的降幅較大，達到了8.17%。其原因可能是無包裝空氣凍結(jié)降溫耗時長，南美白對蝦中微生物產(chǎn)生的微量酶物質(zhì)仍有部分活性在進行酶解作用，使其進行較為緩慢的生理生化反應(yīng)[19-21]。并且肌肉暴露在空氣中直接凍結(jié)，水分散失，進一步使該組南美白對蝦的彈性下降。

對蝦經(jīng)過4種不同方式凍結(jié)處理后，其咀嚼性發(fā)生了變化，咀嚼性的降低會使南美白對蝦在貯藏期間產(chǎn)生很小的纖維感，能賦予南美白對蝦更好的口感[20-21]。新鮮對蝦的咀嚼性為268.74 g，而真空包裝凍結(jié)(ICF-1、SAF-1)的咀嚼值與新鮮對蝦相近，因此口感較好。該結(jié)果也與前人通過電鏡照片發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，對蝦在無包裝的凍結(jié)下肌肉細胞表面出現(xiàn)明顯的縫隙和裂痕，這都說明無包裝食品水分散失，產(chǎn)生低溫凍裂，因此其咀嚼性降低。

2.4 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦肉組織的影響

南美白對蝦的第2、第3腹節(jié)肌肉噴金后進行SEM拍照觀察，可清楚了解不同凍結(jié)方式處理下的蝦肉表面肌肉組織的粗糙程度。如圖4所示，4種不同凍結(jié)方式對南美白對蝦肌肉組織的影響很大，表面肌肉組織間隙變化明顯。

圖4 南美白對蝦在不同凍結(jié)方式處理下電鏡觀察Fig.4 Electron microscopy of Penaeus vannamei treated by different freezing modes

其中，ICF-1的蝦肉表面光滑，肌肉組織排列整齊致密，無明顯間隙，具有清晰肌肉紋理。該凍結(jié)條件下的南美白對蝦可在105 min內(nèi)降溫至-15 ℃，-5～0 ℃最大冰晶生成帶約5.5 min，耗時較短，凍結(jié)階段形成的冰晶小且均勻，對肌肉組織無明顯傷害，對蝦肉質(zhì)口感變化最小。經(jīng)過ICF-0后，組織表面肌肉較為平滑無明顯間隙，但略有毛邊，無明顯的肌肉紋路，因為ICF-0僅需9 min即可凍結(jié)完成，蝦肉的最大冰晶生成帶極短僅為0.617 min，但由于浸漬液體濃度及其特殊性的影響，導(dǎo)致其肌肉組織致密且產(chǎn)生毛邊。SAF-1對南美白對蝦肌肉的影響較大，凍結(jié)后產(chǎn)生少量、細微裂紋，間隙較小。SAF-0的南美白對蝦，由于凍結(jié)時間和最大冰晶生成時間較長，蝦體表面無包裝保護，表面組織形成的間隙最大，裂縫寬度可達200 μm，其口感肉質(zhì)與新鮮對蝦相比的變化也是最大的。

2.5 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦PPO的影響

南美白對蝦，特別是蝦頭部分在凍結(jié)過程中，極易褐變，由于蝦頭中的酪氨酸及其衍生物等水溶性的色原物質(zhì)，在對蝦PPO酶與微生物等的作用下，氧化生成大量黑色素，蝦頭黑變[22-23]。隨著冷凍時間的延長，南美白對蝦體內(nèi)的PPO活性逐漸減弱。通過不同凍結(jié)處理后南美白對蝦蝦頭PPO活性的探究，可了解其氧化黑變程度及進度。

如圖5所示，新鮮組南美白對蝦蝦頭的PPO活性可達90 U，氧化作用強烈，蝦頭迅速褐變黑化。4種不同凍結(jié)方式處理的蝦頭PPO活性與新鮮對蝦蝦頭相比有顯著差異(P<0.05)，且相互差異明顯。ICF-0組蝦頭PPO活性降至18.5 U，相比CK組降幅最大，下降了79.4%，對蝦體內(nèi)PPO酶活大幅度減弱，氧化褐變作用大大減緩，保鮮效果最好。ICF-1由于其降溫凍結(jié)速率快，PPO活性23.5 U，活力降幅73.9%，滅活效果相對空氣凍結(jié)組較好。SAF-0的PPO滅活效果相對較差，PPO活力降至31.5 U，降幅為65%。4種凍結(jié)方式中效果最差的SAF-1，降幅可達58.9%，PPO活力為37 U。對照組和4種凍結(jié)方式下的南美白對蝦PPO活性大小分別是ICF-0

圖5 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦PPO活性的影響Fig.5 Effects of different freezing methods on PPO of Penaeus vannamei

由此可見，凍結(jié)處理對南美白對蝦，尤其是蝦頭等易褐變黑化部位的PPO活性具有明顯的抑制作用，可有效減弱對蝦的氧化，減緩其褐變腐敗。且浸漬凍結(jié)與空氣凍結(jié)、真空包裝與無包裝處理的效果對比明顯。同等條件下，液體浸漬凍方式降低酶活的效果好于空氣凍結(jié)；無包裝效果優(yōu)于真空包裝的對蝦。

2.6 凍結(jié)方式對南美白對蝦鹽溶性蛋白含量的影響

由圖6可發(fā)現(xiàn)，新鮮對蝦的鹽溶性蛋白含量為127.51 mg/g，當進行不同方式處理后再凍結(jié)的對蝦，蛋白質(zhì)的鹽溶性均不同程度的降低。ICF-0和ICF-1鹽溶性蛋白含量下降程度相比空氣凍結(jié)組下降較少且兩兩接近，分別為113.74 mg/g和114.60 mg/g。其中ICF-1組對蝦體內(nèi)鹽溶性蛋白的含量與新鮮對蝦含量相差最小，但是經(jīng)顯著性差異分析后發(fā)現(xiàn)兩者差異顯著(P<0.05)。

圖6 不同凍結(jié)方式對南美白對蝦鹽溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of different freezing methods on salt-soluble protein content of Penaeus vannamei

經(jīng)SAF-1的鹽溶性蛋白含量為109.12 mg/g，比新鮮組對蝦的蛋白質(zhì)變性程度較大，下降了18.5 mg/g。SAF-0對蝦鹽溶性蛋白含量108.35 mg/g，為4組處理方式中變性程度最大，保鮮效果最差的。

對比液體浸漬(ICF-0、ICF-1)和空氣凍結(jié)(SAF-0、SAF-1組)的鹽溶性蛋白含量可知，液體浸漬凍結(jié)的對蝦蛋白質(zhì)變性程度更低，保鮮效果更好，差異極顯著(P<0.01)，這是由于浸漬凍結(jié)的降溫速度快，對蝦中自由水結(jié)合水形成的冰晶細小又分布均勻，水分子對肌肉組織的影響較小。南美白對蝦的迅速降溫可有效減弱其體內(nèi)的脂肪氧化程度及蛋白間的相互作用，浸漬凍結(jié)對蝦的脂肪氧化程度相對空氣凍結(jié)低，說明產(chǎn)生的脂肪氧化產(chǎn)物相對較少，而脂肪氧化產(chǎn)物能與親質(zhì)子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，如與肌肉中的游離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和氨基磷脂反應(yīng)[24-26]，如短鏈脂肪酸及醛類與蛋白質(zhì)結(jié)合，使肌動球蛋白的溶解度下降，從而加劇蛋白質(zhì)變性程度。因此，液體浸漬凍結(jié)法的保鮮效果優(yōu)于靜止空氣凍結(jié)法。

對比不同包裝方式的同種凍結(jié)處理，鹽溶性蛋白含量的變化不大，真空包裝的保鮮效果稍優(yōu)于無包裝處理。

3 結(jié)論

南美白對蝦經(jīng)4種不同凍結(jié)方式處理后，以真空包裝聯(lián)用浸漬凍結(jié)組的保鮮效果較好，經(jīng)掃描電鏡觀察到蝦肉表面光滑，肌肉組織排列整齊致密，無明顯間隙，具有清晰肌肉紋理。此外，該凍結(jié)方式所得各項指標與新鮮南美白對蝦較為接近，并且其硬度、恢復(fù)性、彈性、鹽溶性蛋白含量等指標均高于其他凍結(jié)組，咀嚼性僅次于真空包裝聯(lián)用空氣凍結(jié)組，PPO僅次于單一浸漬凍結(jié)組。