魏冬，范文來(lái)*，徐巖

1(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122)

白酒酒糟是高粱蒸煮加曲后經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾后的殘?jiān)?，含有較豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括粗蛋白、脂肪、糖類、維生素、無(wú)機(jī)鹽和許多風(fēng)味物質(zhì)等，如鮮酒糟中粗蛋白含量約為6.99%，干酒糟中粗蛋白含量高達(dá)16.78%[1]。

早期研究大都關(guān)注酒糟中蛋白、淀粉、脂肪等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的分析[1-2]，自20世紀(jì)80年代開(kāi)始，日本研究人員開(kāi)始研究清酒糟的多肽，并在清酒糟中發(fā)現(xiàn)抗高血壓的ACE抑制肽[3-4]。目前白酒酒糟中多肽成分的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

多肽常見(jiàn)的研究方法包括分離純化和結(jié)構(gòu)分析兩方面。其中分離純化方法主要有離子交換色譜法[5]、反相高效液相色譜法(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)[6]、電泳法[7]等技術(shù)，而常用的多肽結(jié)構(gòu)分析技術(shù)主要有電噴霧離子化質(zhì)譜(electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS)[8]、基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)[9]等。

半制備RP-HPLC技術(shù)不僅分離效果好，而且兼具制備作用，是目前使用的較為廣泛的分離制備方法[10]。Q-TOF-MS技術(shù)作為高分辨質(zhì)譜具有分辨能力強(qiáng)、分析速度快等特點(diǎn)[11]。利用RP-HPLC的高效分離和Q-TOF-MS技術(shù)的靈敏性，對(duì)成分復(fù)雜的樣品的鑒定和分析效果顯著[12]。

本研究以濃香型白酒酒糟為對(duì)象，建立了半制備RP-HPLC分離技術(shù)，結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS對(duì)酒糟中水溶性多肽進(jìn)行分離、鑒定，并試圖發(fā)現(xiàn)其中的功能性多肽。白酒酒糟中功能性多肽的研究對(duì)提高酒糟的附加值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒酒糟取自某酒業(yè)股份有限公司，當(dāng)天取樣后于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?；超純?Millipore-Q系統(tǒng))；乙腈、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA),Sigma-Aldrich公司，色譜級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5418)，德國(guó)Eppendorf公司；磁力加熱攪拌器(MS-S)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-300RL)，瑞士BUCHI公司；半制備型高效液相色譜儀(Waters 2767)，美國(guó)Waters公司；Xbridge BEH C18反相色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm)，美國(guó)Waters公司；超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司。

1.3 酒糟前處理

取出在-20 ℃冰箱中儲(chǔ)藏的白酒酒糟于常溫下放置5 h解凍后備用；稱取100 g酒糟樣品，加入200 mL超純水，于40 ℃恒溫條件下攪拌60 min，將攪拌后的渾濁溶液進(jìn)行離心(4 ℃，3 800×g，30 min)，取上清液，用濾紙(Whatman No.2)過(guò)濾，進(jìn)一步高速離心(4 ℃，10 000×g，20 min)。上清液經(jīng)0.22 μm水系濾頭過(guò)濾后用超濾管(截留分子量> 1 kDa)超濾，收集下層溶液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/20；再凍干后復(fù)溶至質(zhì)量濃度為100 mg/mL(記為R)以備用。

1.4 半制備RP-HPLC分離酒糟中水溶性肽

色譜柱：Xbridge BEH C18反相色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A超純水(含體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA)、B乙腈(含體積分?jǐn)?shù)0.08%的TFA)；洗脫程序：0～60 min，90%～40%A；60～70 min，40%～90%A；流速：2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：800 μL。

1.5 UPLC-Q-TOF-MS鑒定多肽氨基酸序列

將半制備分離后收集的各個(gè)組分分別旋蒸、凍干并復(fù)溶，待UPLC-Q-TOF-MS分析，利用質(zhì)譜軟件Biolynx解析鑒定。

色譜柱：BEH C18反相色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A 100%乙腈、B超純水(0.1%甲酸)；洗脫梯度：0～0.1 min，2%A；0.1～8 min，2%～40%A；8～10 min，40%～80%A；10～12 min，80%～100%A；12～12.1 min，100%～2%A；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：200～500 nm；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧源(electrospray ionization，ESI)；毛細(xì)管電壓：3 500 V；錐孔電壓：20 V；模式：正負(fù)離子雙模式；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；碰撞池電壓：6V；離子掃描范圍：m/z20～2 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 半制備RP-HPLC分離酒糟中水溶性肽

RP-HPLC能根據(jù)溶質(zhì)的極性大小使其達(dá)到分離的效果。實(shí)驗(yàn)選用波長(zhǎng)214 nm表征多肽的分離效果。根據(jù)圖1的紫外吸收情況，把R溶液共分為12個(gè)組分。

圖1 酒糟樣品在214 nm處的反相制備色譜圖Fig.1 Semi-preparative RP-HPLC separation of distilled spent grains at 214 nm

2.2 UPLC-Q-TOF-MS鑒定多肽的氨基酸序列

在分析未知物結(jié)構(gòu)時(shí)，無(wú)法預(yù)知它是否適合于正離子或負(fù)離子電離，在這種情況下，進(jìn)行正離子和負(fù)離子分析是特別有用的[14]。本研究分別采用正離子[M+H]+和負(fù)離子[M-H]-兩種模式，通過(guò)對(duì)比正負(fù)離子模式在同一保留時(shí)間下的質(zhì)譜圖，判斷母離子m/z的大小。

以組分F3在1.055 min處的質(zhì)譜圖為例進(jìn)行多肽結(jié)構(gòu)分析。從RT 1.055 min時(shí)的負(fù)離子質(zhì)譜圖(圖2-a)可看出，圖中存在2個(gè)負(fù)離子峰[M-H]-，m/z分別為267.3和282.1，而在相對(duì)應(yīng)的正離子質(zhì)譜(圖2-b)上只出現(xiàn)1個(gè)分子離子峰[M-H]-=269.3。電噴霧離子源可能使樣品基質(zhì)與溶劑生成加合物，故推測(cè)m/z282.1為溶劑峰，m/z267.3為多肽峰。

a-組分F3的負(fù)離子質(zhì)譜圖；b-組分F3的正離子質(zhì)譜圖圖2 組分F3在1.055 min時(shí)離子質(zhì)譜圖Fig.2 Ion mass spectrum of fraction F3 at 1.055 min

絕大多數(shù)碎片離子是由多肽中相鄰氨基酸間酰胺鍵(—CO—NH—)斷裂產(chǎn)生的。Biolynx解析軟件可以根據(jù)肽的分子離子峰計(jì)算出肽的質(zhì)量數(shù)，且能在對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖上匹配多肽碎片離子。根據(jù)序列匹配度，預(yù)測(cè)出氨基酸序列。在正離子質(zhì)譜中分子離子m/z269.3的分析結(jié)果如下：

其中，A、B、C為肽鍵的氨基端(N端)產(chǎn)生的離子，X、Y、Z則為羧基端(C端)生成的碎片離子，I為亮氨酸和組氨酸的亞胺離子，有下劃線的數(shù)值為質(zhì)譜中出現(xiàn)的碎片離子的質(zhì)荷比m/z(部分質(zhì)荷比數(shù)值由于相對(duì)豐度較低未在質(zhì)譜圖上顯示)。低能碰撞主要產(chǎn)生B和Y離子。質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了多肽Leu-His的碎片離子和組氨酸的亞胺離子，該多肽序列的匹配度為99.84%。

將多肽標(biāo)準(zhǔn)品Leu-His按照1.5中所述方法鑒定，發(fā)現(xiàn)Leu-His的保留時(shí)間與樣品一致，出峰時(shí)間都在1.05 min，且標(biāo)品Leu-His的分子離子和碎片離子(見(jiàn)圖3)與樣品在該保留時(shí)間下的質(zhì)譜圖吻合，進(jìn)一步證明了酒糟中存在多肽Leu-His。

圖3 多肽Leu-His的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖Fig.3 Standard mass spectrum of Leu-His

本實(shí)驗(yàn)中多肽鑒定的標(biāo)準(zhǔn)(置信度)設(shè)定為75%～100%。前3個(gè)組分F1、F2和F3中共鑒定出30種多肽的序列(包括2個(gè)相同序列的多肽)(表1)，其中組分F1共鑒定出5種多肽，F(xiàn)2鑒定出16種，F(xiàn)3鑒定出10種，但F4～F12組分中并未檢測(cè)到多肽。推測(cè)酒糟中水溶性肽的極性較大，在前3個(gè)組分中就已完全從反相柱中流出，即從F4至余下的半制備組分中不存在多肽。

組分F1和F2中RT 1.224 min處的MS圖相同，根據(jù)選定母離子m/z386.3，鑒定為Ala-Ala-Pro-Lys即AAPK。該多肽可能在半制備組分F1和F2收集切換的8.60 min附近出峰。

2.3 酒糟多肽生物活性

酒糟中鑒定出30種多肽與文獻(xiàn)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中9種肽VPSGK、LH、HP、AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF有生物活性，其中6種多肽AAPK[15]、KAGP[16]、TVPK[17]、YE[18]、VPGK[17]、TPF[19]與文獻(xiàn)中的多肽完全或部分匹配，且均具有ACE抑制作用，另外AGP具有抗癌作用[20]；2種多肽VPSGK[21]、LH[22]為抗氧化肽；1種短肽HP[23]具有抑制紫外線引起的紅斑的功能。另外，抗氧化肽LH和ACE抑制肽YE也具有抑制紫外線引起的紅斑的功能。

表1 酒糟中鑒定出的水溶性多肽Table 1 Water-soluble peptides identified in distilled spent grains

到目前為止，在清酒糟中鑒定出6種具有ACE抑制活性的功能性多肽RF、VW、VWY、YW、FMN、IYPRY[3-4]；而我國(guó)濃香型酒糟中共鑒定出9種功能性多肽。除了與清酒糟中多肽具有相同的ACE抑制活性之外，部分肽還具有抗氧化等功能，說(shuō)明了白酒糟中多肽功能的多樣性。

研究人員根據(jù)DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)氨基酸序列檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)：清酒糟多肽與大米蛋白有相同的序列[24]。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索本研究中白酒糟多肽的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了與谷蛋白、醇溶谷蛋白等高粱蛋白一致的序列。推測(cè)濃香型白酒酒糟中多肽來(lái)源于高粱蛋白。通過(guò)大曲與環(huán)境微生物如酵母等的代謝活動(dòng)，高粱蛋白被分解形成功能性肽。由于肽的沸點(diǎn)較高，難以在白酒蒸餾過(guò)程中蒸餾出來(lái)而殘留在酒糟中。

3 結(jié)論

本研究在濃香型白酒酒糟中鑒定出30種水溶性多肽，包括6種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF，2種抗氧化肽VPSGK、LH和1種抑制紫外線引起的紅斑的功能短肽HP。由于多肽合成周期較長(zhǎng)，接下來(lái)的工作將圍繞多肽的驗(yàn)證進(jìn)一步合成余下的20多種多肽，并開(kāi)始進(jìn)行酒糟中多肽的定量工作。研究結(jié)果表明，白酒酒糟能富集更多的生物活性肽，這將為我國(guó)白酒酒糟深加工或高附加值利用提供理論基礎(chǔ)。