唐柯，張小倩，李記明，姜文廣，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇 無錫，214122) 4(煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰荆綎| 煙臺(tái)，264000)

顏色是葡萄酒質(zhì)量評(píng)判的重要依據(jù)之一。一方面，花色苷是紅葡萄酒中主要的呈色物質(zhì)，對(duì)紅葡萄酒的顏色起著決定性作用[1-2]；同時(shí)花色苷還可與其他物質(zhì)(如單寧)結(jié)合，進(jìn)而影響葡萄酒的口感，從而對(duì)葡萄酒的品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響[3]。葡萄酒中的花色苷，一部分來自葡萄中的花色苷，另一部分則是花色苷在發(fā)酵過程中與其他物質(zhì)反應(yīng)，形成花色苷的衍生物[4]?；ㄉ站哂蓄慄S酮物質(zhì)C6—C3—C6的基本結(jié)構(gòu)[5]。

葡萄酒中花色苷主要以游離、結(jié)合以及聚合的狀態(tài)存在，其中游離態(tài)花色苷主要存在于新鮮葡萄酒中，是新鮮葡萄酒的主要呈色物質(zhì)，而陳釀葡萄酒的顏色主要由花色苷聚合作用決定[6]。游離態(tài)花色苷在葡萄酒儲(chǔ)存階段與其他物質(zhì)結(jié)合而逐漸消失，結(jié)合態(tài)及聚合態(tài)花色苷則受酒齡影響較小[7]。雖然游離態(tài)花色苷在紅酒儲(chǔ)存過程中的濃度不斷下降，但紅酒仍能保持基本的紅色。而這些聚合反應(yīng)涉及復(fù)雜的機(jī)制，包括短期的機(jī)制，如自聚合和輔色作用，以及相對(duì)長(zhǎng)期的機(jī)制，如與黃烷-3-醇、原花青素形成聚合花色苷，以及形成新的色素，如吡喃花色苷及其進(jìn)一步的聚合產(chǎn)物等[8-9]。此外，在新鮮紅葡萄酒中游離花色苷的質(zhì)量濃度大約在400～1 000 mg/L，但在某些情況下可能超過2 000 mg/L[10-11]。

我國葡萄種植區(qū)分布非常廣泛，從東到西或從南到北分布于中國各地，距離超過2 000 km。這些區(qū)域生態(tài)條件差異明顯，如山東葡萄產(chǎn)區(qū)屬于半濕潤(rùn)氣候區(qū)，寧夏葡萄產(chǎn)區(qū)屬半干旱氣候區(qū)，新疆葡萄產(chǎn)區(qū)屬干旱氣候區(qū)[12]。而氣候的多樣性賦予了不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒不同的風(fēng)格和顏色特征。因此，了解不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒花色苷的組成對(duì)于葡萄酒生產(chǎn)是非常有意義的。超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/-mass spectrometry，UPLC-MS/MS)是近年來色譜檢測(cè)技術(shù)的一個(gè)重大發(fā)展，通過獲得目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息，從而可以更多地推斷出目標(biāo)物的種類。而目前國內(nèi)采用UPLC-MS/MS對(duì)產(chǎn)區(qū)葡萄酒花色苷的分析還鮮有報(bào)道。

赤霞珠葡萄是我國種植面積最大的一個(gè)釀酒葡萄品種，本文通過UPLC-MS/MS對(duì)我國4個(gè)主要產(chǎn)區(qū)(山東煙臺(tái)、陜西涇陽、寧夏賀蘭山東麓、新疆石河子)赤霞珠葡萄新酒中主要游離花色苷進(jìn)行分析，明確不同產(chǎn)地赤霞珠葡萄酒中花色苷的種類、含量和組成特征，并進(jìn)一步利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，探討基于花色苷的葡萄酒產(chǎn)地特征性。本研究既可以為建立不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒花色苷評(píng)價(jià)體系提供理論參考，同時(shí)也可以為葡萄酒的產(chǎn)地鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有赤霞珠葡萄酒樣品均由張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰咎峁?，來自山東煙臺(tái)(4)、寧夏賀蘭山東麓(7)、陜西涇陽(5)、新疆石河子(6)4個(gè)產(chǎn)區(qū)。均為2017年葡萄，釀造工藝相同，所有樣品于酒精發(fā)酵結(jié)束2個(gè)月后測(cè)定。

濃HCl、NaCl、醋酸、醋酸鈉、Na2CO3(上海國藥集團(tuán)，分析純)；UPLC分析使用的流動(dòng)相包括甲酸、乙腈(上海安譜科學(xué)儀器有限公司，色譜純)；福林-肖卡試劑、Malvidin-3-O-glucoside標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich公司，純度90%以上，色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters H-Class超高效液相色譜儀，美國Waters公司；A380型紫外分光光度計(jì)，翱藝(上海)儀器有限公司；純水儀，美國Millipore公司；超聲清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

使用甲醇(色譜級(jí))將1 mg的二甲花翠素葡萄糖苷(malvidin-3-O-glucoside，課題組制備，純度98.63%[13])溶解，定容于5 mL的容量瓶中，搖勻。然后取0.1 mL溶液，進(jìn)行不同質(zhì)量濃度梯度稀釋。然后將各稀釋液過0.22 μm的有機(jī)相濾膜，進(jìn)行液相色譜分析，以質(zhì)量濃度梯度為橫坐標(biāo)，液相色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=7 433.3x-2 003.1,R2=0.999 9。

1.3.2 葡萄酒花色苷的UPLC-MS/MS分析

采用Waters超高效液相色譜儀在520 nm進(jìn)行葡萄酒花色苷的檢測(cè)，BEH C18色譜柱(i.d. 100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters)柱溫45 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相A：純乙腈，流動(dòng)相B：2%甲酸。洗脫梯度：0～20 min，2%～16% A；20～28 min，16%～23% A；28～30 min，23%～50% A；30～35 min，50%～100% A；35～37 min，100% A；37～38 min，100%～2.0% A。質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，離子掃描范圍：100～1 000m/z；霧化器壓力：35 psi；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：325 ℃。葡萄酒樣品過0.45 μm濾膜后直接

測(cè)定。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理方法

所有樣品檢測(cè)均重復(fù)3次，采用XLSTAT 2014 (Addinsoft， Paris， France)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒中主要游離花色苷檢測(cè)方法的建立

目前,UPLC-MS/MS已經(jīng)成為花色苷研究不可替代的重要方法，但是花色苷的乙?；?、香豆?；鹊男问竭^多，無法也沒有標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行一一比對(duì)。因此，本研究基于花色苷的紫外-可見光譜、MS的特征離子、碎片離子和文獻(xiàn)結(jié)合，分析樣品中所含游離花色苷的種類。圖1為赤霞珠葡萄酒花色苷的UPLC色譜圖。

圖1 赤霞珠葡萄酒花色苷UPLC圖(520 nm)Fig.1 UPLC chromatogram (520 nm) of anthocyanins in Cabernet Sauvignon wine

5種花色苷單體在MS/MS的正離子模式下，丟失3位上的葡萄糖或?；咸烟牵a(chǎn)生相應(yīng)的花色苷配基碎片離子。Dp、Cy、Pt、Pn、Ma裂解丟失葡萄糖(M-162)+，分別得到m/z303、287、317、301、331的碎片。其他游離花色苷也在該模式下，由于能量的增強(qiáng)，分子離子破碎，出現(xiàn)對(duì)應(yīng)特征離子。表1為葡萄酒中花色苷的定性分析結(jié)果，赤霞珠葡萄酒中共檢測(cè)到16種游離花色苷。除了5種基本花色苷及其乙酰化和香豆?；苌锿猓狙芯窟€檢測(cè)到了花色苷的丙酮酸衍生物和乙醛衍生物。通常，花色苷丙酮酸衍生物出現(xiàn)早于乙醛，在發(fā)酵的初期產(chǎn)生，在發(fā)酵后期，酵母營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)會(huì)利用丙酮酸，使其含量下降?；ㄉ找胰┭苌镌诎l(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)生，它與發(fā)酵的糖量密切相關(guān)[14]。

2.2 不同產(chǎn)地赤霞珠葡萄酒花色苷組成分析

表2是赤霞珠葡萄酒中主要花色苷的種類和含量。

表1 葡萄酒中花色苷的定性分析結(jié)果Table 1 The qualitative results of anthocyanins in wine

表2 赤霞珠葡萄酒游離花色苷種類與含量 單位：mg/L

注：“-”，未檢測(cè)到；NX，寧夏；SD，山東；SX，陜西；XJ，新疆

從表2中可以看出,產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒中花色苷的組成基本一致，含量最多的花色苷均為二甲花翠素葡萄糖苷，在160.29～520.95 mg/L；二甲花翠素乙?；咸烟擒談t次之，含量在60.15～229.02 mg/L；其他含量較高的花色苷還包括甲基花翠素葡萄糖苷、甲基花青素葡萄糖苷及二甲花翠素反式香豆?；咸烟擒?。這與張瑛莉等[15]所做的研究結(jié)果基本一致，張瑛莉等發(fā)現(xiàn)赤霞珠葡萄酒中最主要的花色苷是二甲花翠素葡萄糖苷，占相對(duì)含量的50%以上，煙臺(tái)和昌黎產(chǎn)區(qū)酒的含量基本相同，為59.17%和59.96%，新疆伊犁產(chǎn)區(qū)酒的含量稍低，為55.13%。含量其次的是二甲花翠素乙?；咸烟擒眨?個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒基本相同，均占到總含量的20%左右。3個(gè)產(chǎn)區(qū)酒中其他7種花色苷物質(zhì)含量均較少，濃度差異不大。此外，張瑛莉等只檢測(cè)到9種花色苷，而本實(shí)驗(yàn)則檢測(cè)到16種花色苷，采用UPLC-MS/MS的方法可以更加全面的對(duì)花色苷進(jìn)行分析。

圖2為赤霞珠葡萄酒不同產(chǎn)區(qū)間花色苷含量比較。相對(duì)于其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)，寧夏產(chǎn)區(qū)的赤霞珠總花色苷含量具有較大優(yōu)勢(shì)，含量在621.86～997.68 mg/L，平均含量為840.85 mg/L；山東、新疆的花色苷含量都介于600～700 mg/L，而陜西產(chǎn)區(qū)最低，在309.07～667.54 mg/L，平均含量?jī)H為523.73 mg/L。LIANG等對(duì)甘肅祁連、寧夏玉泉營(yíng)、河北懷來、河北昌黎、山東蓬萊5個(gè)產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒中花色苷含量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)河北懷來與河北昌黎葡萄酒中花色苷含量顯著低于其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)，寧夏玉泉營(yíng)與甘肅祁連2個(gè)產(chǎn)區(qū)花色苷含量較高[16]。有研究報(bào)道，寧夏產(chǎn)區(qū)的晝夜溫差大，溫度無霜期較長(zhǎng)，有效積溫較高，熱量條件適中，干燥度較大，土質(zhì)多為沙壤土部分含有礫石，較適宜赤霞珠生長(zhǎng)[17]。

圖2 不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒花色苷平均含量比較Fig.2 The average content of anthocyanins in the Cabernet Sauvignon wines among different production places

2.3 不同產(chǎn)地赤霞珠葡萄酒花色苷特征分析

判別分析適用于分類明確、依據(jù)研究對(duì)象的特征值判別并劃分歸屬的問題，是一種多元統(tǒng)計(jì)分析的方式。依據(jù)不同的判別方法，建立相應(yīng)的判別函數(shù)，以研究對(duì)象的信息資料來確定判別函數(shù)中的未知系數(shù)，得出判別標(biāo)準(zhǔn)，以此來歸屬樣本。本文以山東、新疆、寧夏、陜西4個(gè)產(chǎn)地作為分類依據(jù)，基于16種游離花色苷的種類和含量進(jìn)行產(chǎn)區(qū)的判別分析。

從圖3可以看出，根據(jù)樣品中花色苷的種類和含量可以將4個(gè)產(chǎn)區(qū)進(jìn)行良好的區(qū)分，4個(gè)產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄酒各自聚為一類。此外，寧夏產(chǎn)區(qū)和新疆產(chǎn)區(qū)與其他產(chǎn)區(qū)有著顯著的差異，分別分布在第二象限和第三象限；山東產(chǎn)區(qū)和陜西產(chǎn)區(qū)葡萄酒花色苷特征則較為接近，特征區(qū)域相鄰。

圖3 不同產(chǎn)地葡萄酒基于花色苷判別分析圖Fig.3 DA map based on anthocyanins according to geographic origin

表3為基于花色苷種類和含量的產(chǎn)地判別分析結(jié)果，4個(gè)產(chǎn)區(qū)的正確預(yù)測(cè)率均為100%。近年來，關(guān)于通過葡萄酒的風(fēng)味成分對(duì)產(chǎn)地、品種特征性的研究持續(xù)不斷，如SOUFLEROS等[18]對(duì)希臘的42款白葡萄酒進(jìn)行分析，結(jié)果表明采用判別分析可以通過氨基酸譜將葡萄品種、年份、地理來源和釀酒類型進(jìn)行良好分類。RODRGUEZ-DELGADO等[19]則實(shí)現(xiàn)基于單體酚的種類和含量對(duì)西班牙紅葡萄酒的產(chǎn)地、品種和年份的有效識(shí)別。而從本研究的結(jié)果可以看出，利用花色苷同樣能夠?qū)⒉煌a(chǎn)區(qū)的葡萄酒區(qū)分開，實(shí)現(xiàn)葡萄酒在產(chǎn)地間的有效識(shí)別，葡萄酒基于花色苷的種類和含量具有良好產(chǎn)地特征性。

表3 產(chǎn)區(qū)判別分析結(jié)果Table 3 DA results according to geographic origin

3 結(jié)論

根據(jù)MS質(zhì)譜圖的分子離子和碎片離子的分析，并與文獻(xiàn)報(bào)道的碎片信息比對(duì)，共定性出16種游離花色苷。赤霞珠葡萄酒第一特征花色苷是二甲花翠素葡萄糖苷，含量160.29～520.41 mg/L；二甲花翠素乙?；咸烟擒談t次之，含量60.15～229.02 mg/L。赤霞珠在寧夏產(chǎn)區(qū)的花色苷含量具有較大優(yōu)勢(shì)，含量在800～900 mg/L之間，山東、新疆的花色苷含量都介于600～700 mg/L之間，而陜西最低，在600 mg/L之下。根據(jù)XLSTAT 2014分析結(jié)果，可以看出不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒基于葡萄酒花色苷的線性判別分析得到滿意的結(jié)果，正確預(yù)測(cè)率為100%。