劉方恬，李孫君，成柯，高吉慧，袁方,2*

1(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070) 2(環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430070)

藍(lán)莓又名藍(lán)漿果、越橘，為杜鵑花科越橘屬，屬小漿果類，呈深藍(lán)色，近圓形，果肉細(xì)膩，甜酸適口，香氣宜人，并且富含維生素、超氧化物歧化酶、花色苷、黃酮等多種生理活性成分。藍(lán)莓具有較強(qiáng)的抗氧化能力，同時具有促進(jìn)視紅素再合成，提高免疫力，延緩衰老及抗癌等多種生理活性功效，是國際糧農(nóng)組織列出的人類五大健康食品之一，被譽(yù)為“漿果之王”[1-2]。自20世紀(jì)80年代起，我國開始從北美引進(jìn)高產(chǎn)的藍(lán)莓品種，現(xiàn)近20個省份有規(guī)模栽培。其主要栽培品種有高叢、矮叢、兔眼藍(lán)莓等，分別適于鮮食和加工等不同用途。雖然起步較晚，但我國藍(lán)莓種植規(guī)模呈逐年擴(kuò)大的趨勢，藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2001年我國藍(lán)莓種植面積為25 hm2左右，2010年超過14 000 hm2，年平均增長量在150%以上[3-4]。與此同時，藍(lán)莓酒、藍(lán)莓復(fù)合果酒及藍(lán)莓果汁飲料開始悄悄興起，然而品質(zhì)參差不齊，尤其在香氣品質(zhì)上仍處在摸索階段。

目前，國內(nèi)外研究中風(fēng)味前體及其風(fēng)味修飾中的關(guān)鍵酶(如β-D-葡萄糖苷酶)已有很多報道[5-7]。β-D-葡萄糖苷酶來源多樣，可以水解糖苷鍵將香氣物質(zhì)從結(jié)合態(tài)變成游離態(tài)，從而達(dá)到增香的目的[7]，已被商業(yè)化生產(chǎn)并且廣泛應(yīng)用到食品工業(yè)領(lǐng)域[8]。許多研究證明利用β-D-葡萄糖苷酶可不同程度地促進(jìn)葡萄酒風(fēng)味前體物釋放。如MARTINO等[9]利用來源于黑曲霉的經(jīng)純化后的β-D-葡萄糖苷酶制劑來研究其對白葡萄酒香氣的影響，結(jié)果表明，酶處理后葡萄酒中單萜物質(zhì)含量(里哪醇、α-松油醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇)是原有含量的2倍，使葡萄酒果香更加濃郁。游離態(tài)或固定態(tài)的酶制劑能夠促進(jìn)葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)顯著增加(約4倍)，尤其對于莫斯卡托葡萄酒，其萜醇(里哪醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇)含量顯著增加[10]。然而，β-D-葡萄糖苷酶制劑在藍(lán)莓酒中的應(yīng)用卻未見報道。從現(xiàn)有報道可以看出，藍(lán)莓鮮果的香氣物質(zhì)主要以醇類、酯類、萜類、醛類化合物為主[11-12]。其中，萜類物質(zhì)是藍(lán)莓中含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)，大約占藍(lán)莓總揮發(fā)性物質(zhì)的20%～30%[13]。萜類香氣物質(zhì)在果實(shí)中多以糖苷鍵合態(tài)的形式存在，由此可以推測β-D-葡萄糖苷酶制劑在藍(lán)莓酒的增香上具有一定潛力。

本文以“奧尼爾”和“密斯蒂”2個南高叢品種藍(lán)莓果為材料發(fā)酵藍(lán)莓酒，利用商業(yè)糖苷酶制劑AR2000對藍(lán)莓酒進(jìn)行水解增香，并測定了酶促增香對其香氣及其他重要品質(zhì)指標(biāo)的影響，探討其在不同品種藍(lán)莓酒中的作用效果以及伴隨的品質(zhì)變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓鮮果(南高叢品種密斯蒂和奧尼爾，產(chǎn)自湖北黃陂)，湖北牧童藍(lán)莓有限公司；葡萄酒活性干酵母D254、果膠酶Pectinase EX，法國Lallemand公司；Rapidase AR 2000糖苷酶制劑(簡稱AR2000)，DSM公司；白砂糖，焦亞硫酸鉀等均為市售食品級；福林酚試劑(分析純)，蘆丁(分析純)，DPPH(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸(分析純)，飛揚(yáng)生物化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

手持式數(shù)字折射儀(PAL-1)，日本ATAGO公司；電熱恒溫水浴鍋(HWS-12)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器(S22-2)，上海司樂儀器有限公司；氣相色譜儀(Agilent 6890)、質(zhì)譜儀(Agilent 5973)，美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓酒發(fā)酵工藝流程

1.3.2 酶解處理

加酶量實(shí)驗(yàn)中，2個品種的藍(lán)莓酒各取50 mL，分別加入0、25、35 mg/L AR2000酶液于30 ℃下酶解4 h后，于-20 ℃冷凍保存。

揮發(fā)性香氣實(shí)驗(yàn)中，藍(lán)莓新酒充分混勻灌裝后取100 mL于-20 ℃冷凍作為對照組，酶處理的條件為2.5 g/100 mL加酶量，30 ℃，酶解4 h。2個品種的藍(lán)莓酒各取1瓶密封置于4 ℃自然陳釀1年，作為自然陳釀組。

1.3.3 藍(lán)莓酒總花色苷、總酚和總黃酮含量測定

藍(lán)莓酒總花色苷含量參照LEE等[14]的方法，采用pH值示差法測定藍(lán)莓酒中總花色苷的含量。藍(lán)莓酒總酚含量參照李巨秀等[15]的方法，采用Folin-Ciocalteu比色法。藍(lán)莓酒總黃酮含量測定參照李世燕等[16]采用三氯化鋁比色法。

1.3.4 藍(lán)莓酒還原力和DPPH清除率測定

藍(lán)莓酒還原力的測定：將藍(lán)莓酒樣液稀釋4倍，之后取50 μL稀釋后的樣品于試管中，依次加入2.5 mL 2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和質(zhì)量濃度10 g/L鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻后，于50 ℃條件下水浴20 min，之后快速冷卻,加入質(zhì)量濃度100 g/L三氯乙酸溶液2.5 mL，混合均勻。取5 mL反應(yīng)液于試管中，加5 mL蒸餾水和質(zhì)量濃度1 g/L FeCl3溶液5 mL，充分混勻。以蒸餾水為參比，于700 nm波長處測定樣品吸光度。每個樣品重復(fù)測定3次。用Vc標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以mg/L Vc計(jì)算。

藍(lán)莓酒DPPH清除率測定:將藍(lán)莓酒樣液稀釋5倍，取0.05 mL稀釋后的樣品和2.95 mL DPPH溶液(0.1 mol/L，調(diào)整吸光度至0.650左右)于試管中，混合均勻后，室溫避光靜置15 min，以體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇為對照，于517 nm波長下測定其吸光值(Ai)?？瞻捉M為取0.05 mL稀釋后的樣品和2.95 mL體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇溶液(Aj)。對照組為取0.05 mL蒸餾水和2.95 mL DPPH溶液(A0)。每個樣品重復(fù)測定3次。

(1)

式中：Ai為樣液與DPPH反應(yīng)后的吸光值；Aj為樣液與80%甲醇反應(yīng)后的吸光值；A0為蒸餾水與DPPH反應(yīng)后的吸光值。

1.3.5 固相微萃取條件

準(zhǔn)確量取2 mL樣品移入10 mL螺口樣品瓶中，加入8 mL飽和NaCl溶液，10 μL內(nèi)標(biāo)(4-辛醇，50 mg/L)，加入磁力攪拌子，用聚四氟乙烯隔墊密封，在磁力攪拌器上加熱至50 ℃，平衡15 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附40 min，插入GC進(jìn)樣口解析5 min進(jìn)行GC-MS分析。每個樣品重復(fù)檢測2次。

1.3.6 GC-MS條件

色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至220 ℃，保持3 min；載氣(He)流速1.0 mL/min。

電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～350。

1.3.7 定性、定量分析

定量分析采用外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)相結(jié)合的方法進(jìn)行定量[17]。即通過目標(biāo)化合物選擇離子峰面積與內(nèi)標(biāo)物選擇離子峰面積之比與這2種化合物的質(zhì)量濃度之比建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藍(lán)莓酒中香氣成分的含量。

1.3.8 香氣活性值(odor activity values, OAVs)

根據(jù)文獻(xiàn)查找每個香氣物質(zhì)在10%左右乙醇溶液中的香氣閾值，根據(jù)樣品中香氣物質(zhì)的含量和香氣閾值之比計(jì)算OAV。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS statistics 22對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)

2個品種藍(lán)莓果實(shí)及新酒的基礎(chǔ)理化指標(biāo)見表1。2個品種藍(lán)莓鮮果在可溶性固形物、含水量、密度以及pH值上差異不大，但是“密斯蒂”藍(lán)莓的氨基酸態(tài)氮含量約為“奧尼爾”藍(lán)莓的2倍，并且2種藍(lán)莓果的氮含量均低于正常干型果酒發(fā)酵所需量(140～350 mg N/L)[18]，為保證發(fā)酵順利進(jìn)行，在發(fā)酵起始時添加了300 mg/L磷酸氫二銨。按照上述工藝流程釀制而成的藍(lán)莓酒，其酒精度含量約為10%左右，殘?zhí)橇?4 g/L，顏色為紫紅色，具有藍(lán)莓品種特有的香氣。

表1 兩個品種藍(lán)莓果實(shí)及新酒的基礎(chǔ)理化指標(biāo)Table 1 Basic parameters of berry and young wine inthis study

2.2 酶解處理對藍(lán)莓酒抗氧化物質(zhì)及抗氧化活性的影響

經(jīng)酶制劑AR2000處理前后， “密斯蒂”和“奧尼爾”藍(lán)莓酒抗氧化物質(zhì)的含量及抗氧化活性見表2。

表2 不同加酶量處理對“密斯蒂”和“奧尼爾”藍(lán)莓酒抗氧化物質(zhì)的影響Table 2 Effect of different enzyme addition on the antioxidants in “Misty” and “O’Neal” blueberry wines

注：同一行不同字母表示顯著性差異(P<0.05,n=3)，下同。

由表2可知，“密斯蒂”藍(lán)莓酒總花色苷、總酚以及總黃酮的含量均高于“奧尼爾”藍(lán)莓酒，并且“密斯蒂”藍(lán)莓酒的還原力和DPPH清除率也高于“奧尼爾”藍(lán)莓酒。比較不同加酶量處理可知，2個品種的藍(lán)莓酒在酶處理過后的花色苷明顯低于不加酶處理(P<0.05)，藍(lán)莓酒花色苷的含量隨著酶添加量的增加而下降，說明β-葡萄糖苷酶對花色苷具有水解作用[19]，過多添加可能會對藍(lán)莓酒的顏色品質(zhì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。酶處理對藍(lán)莓酒其他的抗氧化物質(zhì)以及抗氧化活性的影響不大。從品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇了25 mg/L的加酶量進(jìn)行后續(xù)的香氣實(shí)驗(yàn)。

2.3 酶解處理和自然陳釀對藍(lán)莓酒香氣物質(zhì)的影響

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(SPME-GC-MS)技術(shù)對藍(lán)莓酒香氣進(jìn)行了分析，香氣成分的總離子流見圖1。

a-密斯蒂藍(lán)莓酒；b-奧尼爾藍(lán)莓酒圖1 藍(lán)莓酒香氣成分總離子圖Fig.1 Total ion chromatography of volatile compounds in blueberry wines

對“奧尼爾”和“密斯蒂”藍(lán)莓酒，加入β-葡萄糖苷酶和對照組以及陳釀1年組的藍(lán)莓酒香氣進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表3。共定量分析了22種香氣成分，其中包含9種酯類物質(zhì)、1種醛類物質(zhì)、9種萜類物質(zhì)、2種醇類物質(zhì)和1種酚類物質(zhì)。根據(jù)這些化合物的質(zhì)量濃度和香氣閾值，計(jì)算出OAVs(表4)，其中OAV大于1的物質(zhì)有14種，被認(rèn)為是藍(lán)莓酒中的香氣貢獻(xiàn)成分[20]。對比“密斯蒂”和“奧尼爾”2個品種藍(lán)莓酒的香氣成分，發(fā)現(xiàn)主要在萜類香氣物質(zhì)上差異較大?！懊芩沟佟彼{(lán)莓酒的萜烯類香氣物質(zhì)的種類和含量均高于“奧尼爾”藍(lán)莓酒。藍(lán)莓酒中萜類化合物OAVs大于1的有桉葉油素、芳樟醇，α-松油醇，桃金娘烯醇，香芹醇和β-香茅醇，其中芳樟醇和桃金娘烯醇的OAVs最高。這些萜類香氣物質(zhì)多具有草香、木香、花香和樟腦樣香氣，賦予了藍(lán)莓酒特殊的風(fēng)味。萜類物質(zhì)在藍(lán)莓中存在非常廣泛，品種間差距較大[12]，但是目前市面上的藍(lán)莓酒大多未標(biāo)明品種名稱，有的為混合品種釀制而成，這可能造成藍(lán)莓酒香氣品質(zhì)參差不齊。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明品種差異對藍(lán)莓酒的香氣物質(zhì)影響較大，所以原材料的選擇是保持藍(lán)莓酒香氣品質(zhì)穩(wěn)定性的重要因素之一。

表3 “密斯蒂”和“奧尼爾”藍(lán)莓酒中的揮發(fā)性香氣成分 單位：μg/L

注：同一行不同字母表示顯著性差異(P<0.05,n=3)；ND表示未檢出。*酶處理的條件為25 mg/L加酶量，30 ℃，酶解4 h。

表4 “密斯蒂”和“奧尼爾”藍(lán)莓酒中的揮發(fā)性香氣成分OAVs>1結(jié)果Table 4 Volatile compounds with OAVs>1 in “Misty” and “O’Neal” blueberry wine

續(xù)表4

序號香氣成分“密斯蒂”藍(lán)莓酒OAV“奧尼爾”藍(lán)莓酒OAV香氣閾值/(μg·L-1)對照酶處理?自然陳釀對照酶處理自然陳釀10桃金娘烯醇myrtenol7[27]31.132.731.416.419.018.711E-香芹醇E-carveol200[28]1.11.11.10.90.80.812β-香茅醇β-citronellol100[23]2.72.11.61.71.11.113苯乙醇phenylethyl alcohol14 000[23]1.21.21.210.011.512.114丁子香酚eugenol6[23]5.87.32.843.857.237.0

注：酶處理的條件為25 mg/L加酶量，30 ℃，酶解4 h。

酶處理和自然陳釀對萜類香氣物質(zhì)的影響較大。酶處理和自然陳釀處理之間并無顯著差異。酶處理藍(lán)莓酒中2-茨醇和α-松油醇的含量顯著高于對照組(P<0.05)，而芳樟醇則顯著低于對照組(P<0.05)。并且2個品種的藍(lán)莓酒表現(xiàn)出類似的趨勢。在果實(shí)中，香氣物質(zhì)一部分以游離態(tài)的形式存在，另外一部分則以糖苷鍵合態(tài)香氣前體的形式存在[21]。糖苷鍵合態(tài)前體物質(zhì)本身不具有香氣活性，但是通過酸水解或者酶解的方式轉(zhuǎn)化為具有香味的香氣物質(zhì)[21]。但是在藍(lán)莓中，糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的報道不多。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明藍(lán)莓中的萜類物質(zhì)有一部分以糖苷的形式存在，這一部分糖苷類物質(zhì)會被β-葡萄糖苷酶水解，并且效果與自然陳釀過程中發(fā)生的緩慢酸水解作用相似?？梢姦?葡萄糖苷酶在藍(lán)莓酒增香中具有一定的應(yīng)用潛力。

從表3可以看出，藍(lán)莓酒中酯類物質(zhì)比較豐富，其中OAVs大于1的有丁酸乙酯，乙酸異戊酯，苯甲酸甲酯，己酸乙酯和辛酸乙酯。酯類物質(zhì)主要在酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生，是產(chǎn)生果酒花香和果香的重要成分。在“密斯蒂”藍(lán)莓酒中，酶解處理后葵酸乙酯和琥珀酸二乙酯的含量顯著低于對照組(P<0.05)；而在“奧尼爾”藍(lán)莓酒中，酶解處理和陳釀組的己酸乙酯含量顯著低于對照組(P<0.05)，說明AR2000糖苷酶具有一定的酯酶活性，并且對于長鏈脂肪酸酯的水解作用效果更為明顯，這一結(jié)果也與之前報道的一致[22]。但是由于長鏈脂肪酸酯的OAVs大多低于短鏈的脂肪酸酯，例如本研究中葵酸乙酯和琥珀酸二乙酯的OAVs均小于1，說明這種酯酶的活性可能對整體風(fēng)味的影響較為有限。

此外，藍(lán)莓酒中檢測到的醛類，醇類，酚類，其中OAVs大于1的有苯乙醇(玫瑰味)和丁子香酚(丁香味)?！皧W尼爾”藍(lán)莓酒中的丁子香酚的含量明顯高于“密斯蒂”藍(lán)莓酒。所以“奧尼爾”藍(lán)莓酒丁子香酚的OAV(37.0～57.2)也明顯高于“密斯蒂”藍(lán)莓酒中丁子香酚的OAV(2.8～7.3)。說明丁子香酚可能是造成2種藍(lán)莓酒香氣差異的重要揮發(fā)性物質(zhì)之一。相比于對照組，酶解處理使“密斯蒂”藍(lán)莓酒中的丁子香酚的含量顯著提高(P<0.05)，“奧尼爾”藍(lán)莓酒中丁子香酚在酶處理后也有升高但是相比于對照組不顯著，說明丁子香酚在藍(lán)莓中也有部分以糖苷鍵合態(tài)的形式存在，酶解處理能加速其水解釋放過程。酶解處理并未使醛類和醇類產(chǎn)生明顯差異，說明酶解對這些香氣物質(zhì)的影響不大。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用單一品種的藍(lán)莓果進(jìn)行果酒發(fā)酵，利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法對2個品種的藍(lán)莓酒的香氣成分進(jìn)行了分析，共定量檢測了22種香氣成分。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)品種對藍(lán)莓酒的揮發(fā)性香氣成分具有一定影響。經(jīng)過葡萄糖苷酶AR2000處理，藍(lán)莓酒花色苷的含量有所下降但是總酚、總黃酮以及抗氧化活性變化不大。對香氣進(jìn)行氣相色譜的分析后發(fā)現(xiàn)，2個品種藍(lán)莓酒的部分萜類香氣物質(zhì)以及丁子香酚均有不同程度的升高，而且都是良好的呈香物質(zhì)，其效果類似于自然陳釀。說明藍(lán)莓的糖苷前體物質(zhì)有很大的香氣挖掘潛力，酶處理能使其有更好的風(fēng)味表現(xiàn)并且可以縮短陳釀時間。這對提升藍(lán)莓酒的增香工藝提供了良好的理論基礎(chǔ)。