薛鈺婷 冷波（通訊作者）

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 四川 瀘州 646000）

（2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院普外科 四川 瀘州 646000）

急性髓細(xì)胞白血病(AML)是造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病。使白血病細(xì)胞凋亡，是治療白血病的重要治療方法?？鄥A(Matrine，MA)是傳統(tǒng)中藥苦參(Sophora flavescens Ait)的主要成分。研究顯示[1]阿霉素使用在誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡中加入苦參堿可增加其誘導(dǎo)作用。研究報(bào)道[2]順鉑類藥物在聯(lián)合苦參堿藥物使用時(shí)，可增強(qiáng)誘導(dǎo)SH-SY5Y的凋亡的作用，從而提高化療的敏感性[3]。

本研究采用苦參堿藥物作為影響因子，白血病細(xì)胞K562為研究對(duì)象，探索不同濃度苦參堿（0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml）作用于K562細(xì)胞，檢測(cè)凋亡相關(guān)因子caspase-3活性，探索隨苦參堿藥物濃度的增加，對(duì)白血病K562誘導(dǎo)凋亡的作用，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異。為苦參堿今后應(yīng)用于白血病化療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 人白血病細(xì)胞株K562

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 苦參堿(純度＞0.98，相對(duì)分子質(zhì)量248.36)，胎牛血清，RPMI1640培養(yǎng)基，caspase-3檢測(cè)試劑盒等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物配制 苦參堿呈粉末狀，需配制濃度為0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml使其終濃度為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存冰箱的K562細(xì)胞取出，置于37℃水浴箱溶解，離心1000r/5min，去除上清液，用已經(jīng)配制好的培養(yǎng)基培養(yǎng)。復(fù)蘇后的細(xì)胞用培養(yǎng)瓶裝載，置于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天換液傳代。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 用苦參堿以下的濃度（0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml）作用于K562為實(shí)驗(yàn)組，空白組只需加培養(yǎng)基作為對(duì)照，陰性組加0.01%DMSO為對(duì)照。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

凋亡相關(guān)因子caspase-3活性的檢測(cè)

操作步驟：

1.3.1 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/ml加入六孔板，設(shè)計(jì)六個(gè)實(shí)驗(yàn)組，空白組設(shè)置一個(gè)，其余五個(gè)為實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)四孔。在六孔板里的每個(gè)孔加細(xì)胞懸液2ml，第一孔加2ml培養(yǎng)基為陰性組，其余四孔分別加入苦參堿，其終濃度分別是0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml各2ml為實(shí)驗(yàn)組。

1.3.2 置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。

1.3.3 收集對(duì)照樣品（即沒有誘導(dǎo)凋亡的）和樣品組（即誘導(dǎo)凋亡的），離心1000r/5min，去掉清液，PBS洗滌一次。

1.3.4 同前吸盡上清，按每200萬細(xì)胞加入100微升裂解液的比例加入，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。

1.3.5 離心3000r/10min，把上請(qǐng)轉(zhuǎn)移到96孔板。

1.3.6 caspase-3活性檢測(cè)：按試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組應(yīng)用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：不同濃度的苦參堿0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml作用于白血病K562均能升高caspase-3活性，caspase-3活性呈升高趨勢(shì)其受苦參堿濃度增加的影響，呈劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同濃度組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表。

表 不同濃度苦參堿作用K562升高caspase-3活性的作用（72h）

3.討論

急性髓細(xì)胞白血病是多能干細(xì)胞或已輕度分化的前體細(xì)胞核型發(fā)生突變所形成的克隆性惡性疾病。利用我國傳統(tǒng)中醫(yī)優(yōu)勢(shì)，從中藥中尋找經(jīng)濟(jì)、有效、毒副作用小的抗白血病藥物，在醫(yī)學(xué)研究具有前景。如研究證實(shí)[4-5]植物多糖通過阻止凋亡蛋白激活信號(hào)通路，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562分化，使用苦參堿后從而抑制腫瘤細(xì)胞生長[6]。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，caspase的全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，能夠?qū)е鲁绦蛐约?xì)胞死亡。caspase-3活性檢測(cè)試劑盒（caspase-3 Aspartate Protease）是采用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞或組織裂解液中的caspase-3酶活性的試劑盒。本試劑盒基于caspase-3可以催化底物Ac-DEVD-pNA而產(chǎn)生黃色的pNA，通過測(cè)定吸光度來檢測(cè)caspase-3活性。

本研究內(nèi)容為使用不同濃度的苦參堿藥物為影響因子，作用于白血病K562細(xì)胞，按說明書的操作方法檢測(cè)caspase-3，結(jié)果可見：苦參堿均能激活caspase-3（不同的濃度），其作用活性隨著苦參堿的濃度增加而呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理后顯示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，苦參堿作用于白血病K562細(xì)胞能夠升高caspase-3活性，通過激活caspase-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。從探索中發(fā)現(xiàn)，苦參堿藥物有希望成為臨床上輔助治療白血病的一種有效、安全、實(shí)用的新藥物。