采復(fù)拉·大木拉 ，田志龍 ，段新華 ，儲明星

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，烏魯木齊 830000；3.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471003）

轉(zhuǎn)化生長因子 β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族可以調(diào)節(jié)動物細胞的增殖、分化、凋亡，影響動物的胚胎發(fā)育、器官形成以及細胞外基質(zhì)合成和穩(wěn)態(tài)［1］。近些年研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β超家族對胚胎原始生殖細胞形成［2］、睪丸發(fā)育、生殖細胞增殖分化［3］、動物出生后睪丸正常功能維持［4］、精子生成等過程發(fā)揮著重要的生理調(diào)控作用。BMP4基因作為TGF-β超家族成員，參與多種生命活動，促進小鼠精原干細胞的分化［3］。Smad4蛋白是TGF-β超家族的常見轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與TGF-β超家族所有成員的信號傳導(dǎo)。Smad4在小鼠睪丸中表達，并且被認為在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過程中起重要作用［5］。目前，對于BMP4和SMAD4的研究比較多，但BMP4和SMAD4基因?qū)d羊繁殖性狀的作用模式還未確定。因此，本研究以低繁殖力蘇尼特羊公羊和高繁殖力小尾寒羊公綿羊為試驗材料，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測BMP4和SMAD4基因在不同繁殖力公羊下丘腦-垂體-睪丸軸等組織中的表達，以探索BMP4和SMAD4基因在公綿羊繁殖中的作用，為深入理解公綿羊繁殖機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

小尾寒羊來自山東省鄆城縣大鵬農(nóng)牧科技有限公司，蘇尼特羊來自內(nèi)蒙古烏拉特中旗。從中隨機挑選性成熟且健康狀況良好的公羊各3只。屠宰后分別采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、輸精管、腎上腺、睪丸和附睪組織，液氮中保存直至提取RNA。RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司（北京），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量染料均購于大連寶生物；2×Taq PCR Master Mix購于拓英坊科技有限公司（北京）。

1.2 RNA提取和檢測

使用試劑盒提取組織總RNA（詳見試劑盒說明書），使用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，利用儀器測定其純度和濃度。

1.3 引物設(shè)計

利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計熒光定量引物。以RPL19基因做內(nèi)參基因。引物具體信息見表1。

表1 綿羊BMP4、SMAD4和RPL19基因的引物序列和產(chǎn)物大小

1.4 熒光定量PCR

試驗用cDNA合成及RT-PCR和熒光定量PCR試驗過程參考文獻 ［6］。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供步驟進行cNDA的合成，使用2×Taq PCR Master Mix對目的基因進行PCR，最后使用SYBR?PremixExTaqTMⅡ進行熒光定量檢測。熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理參考文獻［6］，即以 RPL19 為內(nèi)參基因，使用 2-△△CT法［7］計算目的基因相對表達量，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，使用鄧肯氏（Duncan's）進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與cDNA合成

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性進行檢測，結(jié)果表明，RNA完整性良好。使用內(nèi)參基因?qū)DNA進行檢測，結(jié)果顯示（圖1），目的片段與預(yù)期的一致，可用于后續(xù)的熒光定量試驗。

圖1 cDNA電泳檢測

2.2 BMP4和SMAD4基因在不同品種公羊繁殖相關(guān)組織中的表達

運用qPCR對小尾寒羊公羊和蘇尼特羊公羊8種繁殖相關(guān)組織中BMP4和SMAD4基因的表達量進行了研究，結(jié)果見圖2。兩個品種比較發(fā)現(xiàn)，BMP4和SMAD4在公綿羊各種組織中均有表達，其中BMP4基因在睪丸中高表達，其次是輸精管、腎上腺，在其他組織中均呈痕量表達。SMAD4基因在睪丸、下丘腦、小腦、大腦中高表達，在其他組織中均中等表達。BMP4基因在低繁殖力蘇尼特公羊睪丸中表達量顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05）。SMAD4基因在低繁殖力蘇尼特公羊8種組織表達量均顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05）。

圖2 BMP4和SMAD4基因在不同品種公羊繁殖相關(guān)組織中的表達

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族中最大的一個亞家族［8］。BMP4是BMP亞家族中的重要成員之一，在哺乳動物體內(nèi)發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用。在生殖系統(tǒng)調(diào)節(jié)中，睪丸和卵巢是BMP4作用的重要靶器官［9］。研究發(fā)現(xiàn)，BMP4不但可促進初級卵泡轉(zhuǎn)化為次級卵泡［10］，還可促進牛卵巢原始卵泡以及次級卵泡直徑的增加并調(diào)控牛卵母細胞成熟［11］。徐業(yè)芬［12］發(fā)現(xiàn)，BMP4抗體處理湖羊卵母細胞可以導(dǎo)致其凋亡并消失。推測BMP4基因是原始卵泡和卵母細胞生存必需因子，可促進卵泡顆粒細胞進一步分化，排卵卵泡進一步成熟，最終表現(xiàn)為排卵數(shù)增加。BMP4基因不僅在綿羊卵巢中發(fā)揮作用，還在山羊中也發(fā)揮著重要功能［13］。秦立紅等［14］報道，BMP4基因在草原紅牛不同發(fā)育時期睪丸組織中均有表達，這說明BMP4基因在草原紅牛睪丸組織中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP4基因在低繁殖力蘇尼特公羊睪丸中表達量顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05），這和前人研究結(jié)果基本一致。

TGF-β超家族信號通路在卵泡發(fā)育、卵母細胞生長以及顆粒細胞增殖、哺乳動物睪丸發(fā)育及精子形成中起重要作用。Smad4作為該信號通路的中心分子在TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用［15］。王玉恒等［16］研究發(fā)現(xiàn)，Smad4在牦牛的多個組織中均有表達，尤其是在生殖系統(tǒng)的卵巢、輸卵管、子宮組織中廣泛表達。郝曉霞［17］研究發(fā)現(xiàn)，Smad4在小鼠睪丸支持細胞、萊氏細胞、管周肌樣細胞和除長形精子之外的所有生殖細胞中表達。在支持細胞中敲除Smad4能夠影響胎兒睪丸索擴張，單獨敲除萊氏細胞中的Smad4對胎兒及成年鼠睪丸發(fā)育無影響。在支持細胞和萊氏細胞中同時敲除Smad4，能夠?qū)е滦∈蟛G丸不育和腫瘤形成。高真真［18］使用免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，Smad4在成年鵪鶉和雞的睪丸生殖細胞和支持細胞中高表達。本研究表明，SMAD4基因在睪丸、下丘腦、小腦、大腦中高表達，且低繁殖力蘇尼特羊公羊顯著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05），再次驗證了SMAD4基因?qū)τ诓G丸功能以及相關(guān)繁殖組織的重要作用。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，BMP4和SMAD4基因在小尾寒羊公羊和蘇尼特羊公羊睪丸中高表達，并且在蘇尼特羊睪丸中的表達量顯著高于小尾寒羊（P＜0.05）。表明BMP4和SMAD4基因在公綿羊繁殖中起一定程度的負調(diào)控作用，這為公綿羊高繁殖性狀選育提供了參考依據(jù)。