畢 超, 呂 康, 何 標(biāo)
(安徽師范大學(xué) 體育學(xué)院,安徽 蕪湖 241002)
細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、受凋亡基因調(diào)控的細(xì)胞有序死亡的現(xiàn)象,細(xì)胞凋亡受一系列凋亡相關(guān)基因的精確控制,如Caspase蛋白家族、Bcl-2蛋白家族、TNF蛋白家族、細(xì)胞色素C(Cytochrome C,cyt-c)等蛋白家族,調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因相互作用形成細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路,主要有死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡三條通路。細(xì)胞凋亡對維持機(jī)體正常發(fā)育和自身穩(wěn)態(tài)具有重要意義。而細(xì)胞凋亡異常將導(dǎo)致腫瘤、帕金森綜合征及阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生。
阿爾茨海默病(AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,多發(fā)于中老年人群,以記憶力減退和認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征,以神經(jīng)纖維纏結(jié)、老年斑和突觸丟失為主要病理特征[1]。細(xì)胞凋亡導(dǎo)致AD海馬神經(jīng)元大量丟失,最終影響海馬的學(xué)習(xí)記憶功能。積極的身體活動作為一種干預(yù)手段能夠有效緩解AD的發(fā)生,有研究證實長期中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動顯著抑制NSE/APP轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬Caspase-3、Caspase-9和Bax等促細(xì)胞凋亡基因的表達(dá),提高抑制細(xì)胞凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平,提高NSE/APP轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)細(xì)胞抗凋亡能力。但運(yùn)動是如何調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因抑制轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡尚不清楚。而Parkin-NEMO-OPA1通路具有抑制細(xì)胞凋亡的能力,運(yùn)動是否通過調(diào)控Parkin-NEMO-OPA1通路抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡?受上述啟示,本研究探討運(yùn)動調(diào)控Parkin-NEMO-OPA1信號通路對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。
選購3月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠12只(南京大學(xué)模式動物研究所),許可證號:SCXK(蘇2015—0001)。將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為轉(zhuǎn)基因運(yùn)動組(TE,N=6)和轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(TC,N=6),選取同系野生型小鼠作為正常對照組(C,N=6)。實驗動物置于標(biāo)準(zhǔn)動物房分籠飼養(yǎng)。
實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,TE組小鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后對TE組小鼠進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)。參照文獻(xiàn)[2]中運(yùn)動強(qiáng)度,以小鼠最大攝氧量45%-55%的強(qiáng)度對TE組小鼠進(jìn)行10周的跑臺運(yùn)動,每周5次,每次訓(xùn)練持續(xù)時間為45min,運(yùn)動結(jié)束后小鼠為7月齡。
TE組小鼠末次運(yùn)動后,對所有實驗小鼠禁食12小時,脫頸處死,分離海馬,低溫保存,待測。
采用RT-PCR檢測方法對Parkin、NEMO、OPA1、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、cyt-c mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,用Trizol法提取小鼠海馬內(nèi)總的RNA,以20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系得到穩(wěn)定的cDNA。實驗操作步驟按照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。按要求設(shè)計合成引物(由上海生工生物有限公司合成),引物序列見表1。按照RT-PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù),以20μL體系進(jìn)行RT-PCR實驗,記錄Ct值。根據(jù)2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。所用儀器為(Thermo Fisher Scientific,美國,型號A28132)。
本文采用RT-PCR技術(shù)檢測各組小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、cyt-c mRNA的表達(dá)情況,如表2所示:與C組相比較,TC組小鼠海馬Caspase-3mRNA的表達(dá)水平升高,差異具有極顯著性(p<0.01),與TC組相比較,TE組小鼠海馬Caspase-3mRNA的表達(dá)水平下降,差異具有極顯著性(p<0.01)。與C組相比較,TC組小鼠海馬Caspase-6mRNA表達(dá)水平升高,差異具有顯著性(p<0.05),與TC組相比較,TE組小鼠海馬Caspase-6mRNA的表達(dá)水平下降,差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較,TC組小鼠海馬Caspase-8mRNA的表達(dá)水平升高,差異具有極顯著性(p<0.01),與TC組相比較,TE組小鼠海馬Caspase-8mRNA的表達(dá)水平下降,差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較,TC組小鼠海馬cyt-cmRNA表達(dá)水平升高,差異具有顯著性(p<0.05),與TC組相比較,TE組小鼠海馬cyt-cmRNA的表達(dá)水平下降,差異具有顯著性(p<0.05)(如圖1所示)。
表1 引物序列一覽表Table 1 Primer sequence of gene
表2 各組小鼠Caspase-3,Caspase-6,Caspase-8,cyt-c相對于GAPDH的mRNA表達(dá)水平
與C組相比,*p<0.05,**p<0.01,與TC組相比,△p<0.05,△△p<0.01
為研究運(yùn)動對Parkin-NEMO-OPA1抗細(xì)胞凋亡通路的影響,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達(dá)情況,如表3所示,與C組相比較,TC組小鼠海馬Parkin mRNA的表達(dá)水平下降,差異具有顯著性(p<0.05),與TC組相比較,TE組小鼠海馬Parkin mRNA的表達(dá)水平升高,差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較,TC組小鼠海馬OPA1mRNA的表達(dá)水平下降,差異具有顯著性(p<0.05),與TC組相比較,TE組小鼠海馬OPA1mRNA的表達(dá)水平升高,差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較,TC組小鼠海馬NEMO mRNA表達(dá)水平升高,差異具有顯著性(p<0.05),與TC組相比較,TE組小鼠海馬NEMO mRNA的表達(dá)水平升高,差異具有顯著性(p<0.05)(如圖2所示)。
表3 各組小鼠Parkin,NEMO, OPA1相對于GAPDH的mRNA表達(dá)水平
與C組相比,*p<0.05,與TC組相比,△p<0.05
細(xì)胞凋亡是真核細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而啟動的內(nèi)部死亡機(jī)制,凋亡信號傳導(dǎo)通路精密調(diào)控機(jī)體的細(xì)胞凋亡,其中線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡最為經(jīng)典[4]。Caspase家族對細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵性作用,是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶,Caspase有多個亞型,其中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者,而Caspase-8和Caspase-9則是細(xì)胞凋亡的啟動者。不同的細(xì)胞凋亡信號通路相互作用,激活Caspase-3和Caspase-6,誘發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。神經(jīng)元細(xì)胞過度凋亡進(jìn)一步降低了神經(jīng)元的存活,影響大腦功能,而AD腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞大量丟失則是神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡的結(jié)果。AD的發(fā)病與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān),淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)的過度表達(dá)、持續(xù)的氧化應(yīng)激和腦損傷均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增多。
本研究發(fā)現(xiàn),7月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、cyt-c、Caspase-8mRNA表達(dá)均顯著高于正常對照組,提示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細(xì)胞凋亡增加。神經(jīng)細(xì)胞凋亡始于AD早期,甚至早于老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成之前。AD患者海馬Aβ含量增加,Aβ通過激活Caspase誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,而Caspase-3又參與了APP的代謝過程,導(dǎo)致Aβ的生成增多。劉慧莉等人[6]通過TUNEL和NISSL染色方法證實APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬出現(xiàn)大量的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和齒狀回神經(jīng)元丟失現(xiàn)象。Aβ導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是通過Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族基因調(diào)控的。Aβ可能通過改變Bcl-2/Bax比值,同時激活Caspase并引發(fā)Caspase酶鏈鎖反應(yīng),促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡。Aβ可以降低Bcl-2的表達(dá)水平,誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,而過度表達(dá)Bcl-2可降低Aβ的神經(jīng)毒性,提高神經(jīng)元的存活率。
APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究較多轉(zhuǎn)基因AD小鼠,7月齡時腦內(nèi)可見明顯的Aβ沉積,海馬神經(jīng)元丟失增多。本研究結(jié)果證實,7月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的能力低于野生對照組,而10周的跑臺運(yùn)動顯著降低APP/PS1小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8和cyt-c mRNA的表達(dá)水平,提示跑臺運(yùn)動通過減少促凋亡因子的表達(dá)抑制AD小鼠海馬細(xì)胞凋亡。研究[7]證實,16周的跑臺運(yùn)動降低NSE/APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬cyt-c、Caspase-3、Caspase-9和Bax的表達(dá)水平,增加了NSE/APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Bcl-2mRNA的表達(dá)水平。研究[8]發(fā)現(xiàn),3個月的跑臺運(yùn)動降低NSE/hPS2m轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層Caspase-3mRNA的表達(dá)水平,提高大腦皮層Bcl-2/Bax比值。上述研究結(jié)果提示,運(yùn)動通過提高海馬神經(jīng)細(xì)胞抗凋亡能力,達(dá)到預(yù)防和緩解AD的目的。
海馬神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡將導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙疾病的發(fā)生,AD患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多。運(yùn)動可以增強(qiáng)突觸可塑性,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,但運(yùn)動調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚不明確。目前就運(yùn)動影響APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究成果相對較少,研究[8]證實,小強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動通過抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元的丟失。但該研究僅通過TUNEL和NISSL染色方法觀察了跑臺運(yùn)動對AD小鼠海馬齒狀回細(xì)胞凋亡的影響情況,沒有對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測。本研究對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行10周的跑臺運(yùn)動干預(yù),結(jié)果證實,跑臺運(yùn)動通過下調(diào)促神經(jīng)細(xì)胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8和cyt-c mRNA的表達(dá)水平,提高了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細(xì)胞抗凋亡能力,降低了海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。
Parkin是位于6q25-27與家族性帕金森綜合征密切相關(guān)的基因,是最早發(fā)現(xiàn)的家族性帕金森綜合征致病基因并命名為Parkin[9]。Parkin表達(dá)于人體所有組織,Parkin可以通過底物蛋白的泛素化調(diào)節(jié)線粒體自噬、蛋白降解,參與帕金森綜合征的發(fā)病過程等。Parkin能夠抑制由線粒體應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。Parkin參與線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程,在細(xì)胞受到外界刺激情況下,Parkin通過募集線性泛素分子組合成復(fù)合體,通過提高NF-κB關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子(NF-κB essential modulator,NEMO)線性泛素化水平,然后進(jìn)一步激活線粒體視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1(optic atrophy type1,OPA1),提高OPA1的轉(zhuǎn)錄水平,OPA1上調(diào)能夠維持線粒體完整性和阻止細(xì)胞凋亡,形成Parkin-NEMO-OPA1信號通路。cyt-c是位于線粒體內(nèi)膜的水溶性蛋白,是最早發(fā)現(xiàn)的由線粒體釋放的促細(xì)胞凋亡蛋白,正常情況下cyt-c不能透過線粒體外膜,而當(dāng)線粒體外膜蛋白聚合成膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔(permeability transition pore,PTP)復(fù)合體,外界刺激使PTP通透性增加導(dǎo)致水分進(jìn)入線粒體,并最終引起cyt-c釋放,而胞質(zhì)內(nèi)以單體存在的Bax在受到外界刺激時形成聚合物整合到線粒體上,使線粒體外膜通透性增加,導(dǎo)致cyt-c釋放增多,從而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Parkin能夠抑制因凋亡刺激誘導(dǎo)的線粒體cyt-c的釋放,證實了Parkin抗細(xì)胞凋亡作用與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)。而線粒體cyt-c的釋放同樣受OPA1活性的影響,提示Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路通過抑制線粒體cyt-c的釋放抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示,7月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1信號通路關(guān)鍵分子Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達(dá)水平顯著低于正常對照組,差異具有顯著性,而cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達(dá)水平均顯著高于正常對照組,提示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1抗細(xì)胞凋亡能力下降,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠海馬線粒體cyt-c釋放增多,上調(diào)Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8等基因的表達(dá)水平,引起海馬細(xì)胞凋亡增多。
耐力訓(xùn)練增加了2型糖尿病小鼠海馬Parkin和OPA1的表達(dá)水平[10]。近期的研究也證實,2周的跑臺訓(xùn)練顯著增加腦缺血大鼠皮層OPA1的表達(dá)水平[11],提示跑臺運(yùn)動可能通過提高OPA1mRNA的表達(dá)水平,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。目前還沒有就Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡方面的研究。本研究發(fā)現(xiàn),10周的跑臺運(yùn)動上調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達(dá)水平,抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達(dá),提示跑臺運(yùn)動通過提高Parkin抗凋亡通路關(guān)鍵分子Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達(dá)水平,降低線粒體cyt-c的釋放和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA表達(dá)水平,抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細(xì)胞凋亡。
APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路mRNA的表達(dá)水平下降導(dǎo)致海馬線粒體cyt-c和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8等促凋亡基因的表達(dá)水平提高,導(dǎo)致APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細(xì)胞凋亡增加。而10周的跑臺運(yùn)動通過提高Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達(dá)水平,降低線粒體cyt-c的釋放和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達(dá)水平,抑制AD小鼠海馬細(xì)胞凋亡。