史簡銘 田進翔 辛超飛 龔漢普 常英健 李廣恒 許建中

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，鄭州 450052）

骨關(guān)節(jié)炎在60歲以上的老年人群中的發(fā)病率達10%，而軟骨自我修復(fù)的能力非常有限，加之老齡化的加劇，骨關(guān)節(jié)炎在各國的發(fā)病率逐年上升[1]。目前骨關(guān)節(jié)炎早期的治療措施主要包括抗炎藥物的使用、關(guān)節(jié)腔使用潤滑劑；骨關(guān)節(jié)炎后期的治療主要為外科手術(shù)治療。近年來動物實驗和臨床研究顯示間充質(zhì)干細胞在骨關(guān)節(jié)炎治療上具有良好的應(yīng)用前景[2-4]，間充質(zhì)干細胞能夠進行自我更新和具有多向分化的能力，而當(dāng)前的研究中間充質(zhì)干細胞的來源主要有骨髓源性干細胞、脂肪源性干細胞、滑膜源性干細胞等[5,6]。而骨髓源性干細胞的來源比較局限，取材時給患者造成一定創(chuàng)傷，且有感染的風(fēng)險；脂肪源性干細胞雖來源豐富但其成軟骨分化能力較弱，而近來研究雖然表明關(guān)節(jié)腔周圍存在固有間充質(zhì)干細胞，但是骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜存在嚴重炎性改變，使其難以成為理想的來源[7]。本實驗旨在探究鼠筋膜源性干細胞的分離，體外培養(yǎng)和鑒定，并在多向分化的潛能上進行研究，以明確筋膜源性干細胞是否具有誘導(dǎo)成軟骨分化能力。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠來源

本實驗所用大鼠軟骨細胞和筋膜源性干細胞均由SD 大鼠體內(nèi)分離所得，大鼠來源于北京維通利華有限公司【SCXK（京）2016-0011】。實驗大鼠均為SPF級，8周齡，體重約240 g，實驗過程中對動物的處置符合赫爾辛基宣言動物倫理學(xué)標準。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco，11330-032），胎牛血清（Thermo Fisher，10099141），Ⅱ型膠原酶（索萊寶，C8150），胰酶（Thermo Fisher，25200056）PE標記的小鼠抗大鼠CD29 單克隆抗體（Thermo Fisher，25029180）、小鼠抗大鼠CD90 單克隆抗體（Thermo Fisher，12090081），F(xiàn)ITI標記的小鼠抗大鼠CD45單克隆抗體（Thermo Fisher，11046180），APC 標記的小鼠抗大鼠CD71 單克隆抗體（Thermo Fisher，17071082），BMP4（Peprotech，12005）、TGF-β3（Peprotech，10036E），成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（Cyagen，RASMD-90031），成軟骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)液（CCM005，R&D systems），成軟骨誘導(dǎo)分化添加劑（CCM020，R&D systems），流式細胞儀（BD FASCAria III），細胞計數(shù)儀（IC1000，上海睿鈺公司），培養(yǎng)用顯微鏡（CKX53，OLYMPUS），離心機（湘儀L500，離心腔直徑Ф320 mm，離心直徑Ф300 mm）。

1.3 筋膜細胞的分離

將大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉過量處死，用電動剃須刀給予大鼠后肢備皮處理，將大鼠浸泡于75%乙醇溶液10 min，用吸水紙擦干大鼠表面的乙醇，轉(zhuǎn)移至無菌操作臺中，用無菌齒鑷提起大鼠臀大肌表面的皮膚，用組織剪橫行剪開，用組織剪鈍性分離至臀大肌表面筋膜，用剪刀小心分離筋膜組織[8]，取出后的筋膜組織用組織洗液（含有10%青鏈霉素）清洗數(shù)遍至筋膜組織呈現(xiàn)近似透明的絮狀，把組織轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中，并置于冰上，盡可能剔除血管、脂肪等組織，用眼科剪剪碎筋膜組織至糊狀，用移液管轉(zhuǎn)移剪碎的筋膜組織至15 ml離心管中，加入等體積的0.25%的Ⅱ型膠原酶，振蕩混勻后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化1 h，每間隔30 min混勻振蕩1次，后再加入0.2%的胰酶消化30 min，消化完成后轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，用10倍體積的完全培養(yǎng)基（含10%的FBS）中止消化，中止消化后，1000 r/min離心5 min，離心機半徑為15 cm，離心后去除上層懸液，用完全培養(yǎng)基重懸細胞，用100目的尼龍濾網(wǎng)過濾，濾過的細胞懸液接種在25 cm培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，72 h后首次換液，以后每48 h換液1次，當(dāng)細胞融合至70%的時候用0.25%胰酶消化后傳至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)擴增培養(yǎng)。

1.4 軟骨細胞的分離

取4只SD大鼠，過量麻醉處死后，浸泡于75%的酒精中30 min，在股骨近端處切下大鼠的雙側(cè)后肢，剪去皮層，置于50 ml 離心管中，用組織洗液反復(fù)洗滌數(shù)遍，在培養(yǎng)皿中打開大鼠的膝關(guān)節(jié)，用眼科剪，沿著軟骨下分別減去股骨髁和脛骨平臺，剪下的組織置于50 ml離心管中用組織洗液反復(fù)洗滌10遍，在無菌的培養(yǎng)皿中仔細分離剪下的軟骨組織，把軟骨周圍的滑膜組織，軟骨下骨徹底分離，收集取得的軟骨，用手術(shù)刀片反復(fù)切取組織，直至組織變的粘稠狀，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，加入0.15%Ⅱ型膠原酶3 ml，置入恒溫培養(yǎng)箱中消化1 h，期間每隔20 min 振蕩混勻一次，1 h 后加入0.25%胰酶2 ml 消化30 min，把消化后的組織倒入50 ml離心管中，加入帶有血清的培養(yǎng)基20 ml中止消化，并用100目的濾網(wǎng)進行過濾，收集過濾后的液體，1000 r/min 離心5 min，離心機半徑為15 cm，棄上清，用含有10%FBS 的DMEM/F-12 重懸細胞，重懸后接種至25 cm的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，當(dāng)細胞融合至80%的時候常規(guī)消化后傳至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)擴增培養(yǎng)。

1.5 筋膜源性干細胞生長曲線繪制

取第3、5、7代筋膜間充質(zhì)干細胞，用完全培養(yǎng)基重懸，用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)，把細胞懸液濃度調(diào)整至1.5×105/ml，以每孔200 μl 接種于96 孔板內(nèi)，96孔板周邊各孔中加入200 μl 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS），其中左側(cè)邊緣加入200 μl完全培養(yǎng)基，共接種6 塊96 孔板，置于37℃，5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日同一時間取1 塊96孔板，每孔加入水溶性甲臢化合物19 μl，吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate,PMS）1 μl，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 h后取出96孔板，于酶標儀中測定490 nm處的吸光度(A)，取96 孔A 的平均值，以A 為縱坐標，時間（d）為橫坐標繪制生長曲線。

1.6 筋膜源性干細胞表面免疫表型鑒定

取5 個1.5 ml 的離心管，每管中重懸第3 代的筋膜源性干細胞1×106，1000 r/min離心5 min，離心完成后棄上清，再次用50 μl的PBS重懸細胞，后將重懸的細胞懸液置于冰盒中，將適量PE 標記的抗CD29（Thermo Fisher，25029180）、CD90（Thermo Fisher，12090081）抗體，F(xiàn)ITI 標記的抗CD45（Thermo Fisher，11046180）抗體，APC 標記的抗CD71（Thermo Fisher，17071082）抗體，分別用50 μl的PBS稀釋混勻后加入對應(yīng)的單細胞懸液中，其中空白對照組加入50 μl 的PBS，手指彈勻各管后，置于冰盒中避光孵育20 min，孵育后，各管中加入800 μl的PBS，1000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)此操作1 次，后用500 μl PBS 重懸后上機檢測，用NovoExpress軟件分析結(jié)果。

1.7 筋膜源性干細胞的成脂誘導(dǎo)分化

使用成脂誘導(dǎo)分化試劑盒，取第2 代的脂筋膜源性干細胞消化重懸，按2×104/cm2的細胞密度接種在12孔板中，均分為誘導(dǎo)分化組與未誘導(dǎo)分化組，誘導(dǎo)分化組每孔加入1 ml 完全培養(yǎng)基，將細胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔3 d 換液，直到細胞融合度達到100%或者過融合；吸走完全培養(yǎng)基后向六孔板中加入2 ml 誘導(dǎo)分化A 液，誘導(dǎo)3 d 后更換成誘導(dǎo)分化B液，24 h后換回A液進行誘導(dǎo)，A液和B 液交替作用3 次，繼續(xù)用B 液維持培養(yǎng)4 d，誘導(dǎo)分化完成；未誘導(dǎo)分化組采用常規(guī)完全培養(yǎng)基，吸走12孔板中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2遍，后每孔中加入1 ml的4%中性甲醛固定細胞20 min，固定完成后用PBS洗滌3遍，后每孔中加入油紅O 1 ml作用10 min，用PBS清洗3遍后在倒置相差顯微鏡下觀察。

1.8 筋膜源性干細胞的成軟骨誘導(dǎo)分化

取第3 代的軟骨細胞、筋膜源性干細胞消化計數(shù)，取27 個15 ml 離心管，9 個標記為軟骨細胞組（A組），18個標記為筋膜源性干細胞組，均分為B、C組，軟骨細胞組（A組）離心管中各重懸2×105個軟骨細胞，筋膜源性干細胞組（B、C）組離心管中各重懸2×105個筋膜源性干細胞，室溫下1000 r/min離心5 min，離心機半徑為15 cm，棄上清，軟骨細胞組（A組）用5 ml常規(guī)完全培養(yǎng)基重懸，筋膜源干細胞組（B、C組）用5 ml的成軟骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，各組再次室溫下1000 r/min 離心5 min，離心機半徑為15 cm，棄上清后，軟骨細胞組（A組）、筋膜源性干細胞C組用0.5 ml常規(guī)完全培養(yǎng)基重懸，筋膜源性干細胞B組用0.5 ml的誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（TGF-β3 10 ng/ml，BMP4 100 ng/ml）重懸[9,10]，再次室溫下1000 r/min離心5 min，離心機半徑為15 cm，保留培養(yǎng)基，擰松各離心管蓋子，垂直放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔2 d 更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，于誘導(dǎo)分化的第28 天收取培養(yǎng)的細胞團塊，獲取的細胞團塊用4%中性甲醛固定24 h，24 h后用尺子測量所獲取的細胞團塊大小，并進行統(tǒng)計分析，測量后用被酒精浸泡過的擦鏡紙包裹細胞團塊，置于包埋盒中，伊紅染液中浸泡1 min，用PBS清洗2 遍后進行梯度脫水（75%、85%、95%、100%乙醇溶液各5min）、透明、浸蠟、包埋等步驟。將包埋好的細胞團塊6°冷臺預(yù)冷，調(diào)整切片機層厚為4 μm 進行切片，切片后做免疫組化染色，通過Image J軟件進行對3D pellet 切片進行免疫組化顯色后的半定量分析，以經(jīng)鑒定培養(yǎng)的軟骨細胞作為對照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，所有數(shù)據(jù)用Levene檢驗方法進行方差齊性分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA），對方差分析有意義者行Bonferroni 法進行兩兩比較，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)的細胞形態(tài)學(xué)觀察

筋膜源性干細胞分離接種后48 h，可見細胞貼壁生長，細胞呈多角形、長梭形，原代細胞在7 d 達到70%融合，細胞傳代后成漩渦狀生長，3 d達90%融合（圖1）。

分離培養(yǎng)的原代軟骨細胞呈圓球形，懸浮狀態(tài)，接種后24 h 開始貼壁，48 h 大部分貼壁伸展，呈多角形、短梭形、三角形，72 h 大部分貼壁，分裂增殖加快。約8 d 匯合成單層鋪滿整個培養(yǎng)皿底面。傳代后生長速度加快，約4 d 左右即可傳代，細胞周圍可見具有折光性的細胞外基質(zhì)，細胞長成一片呈明顯鋪路石樣外觀（圖1）。

圖1 分離培養(yǎng)的細胞形態(tài)學(xué)觀察及筋膜源性干細胞的生長曲線

2.2 筋膜源性間充質(zhì)干細胞的生長動力學(xué)分析

根據(jù)生長曲線圖可見，第3代與第5代間充質(zhì)干細胞增殖能力差別不大，一般有2 d左右的潛伏期，隨即進入對數(shù)生長期，5～7 d后進入平臺期。第7代細胞的增殖能力較前代降低，在5～6 d進入平臺期（圖1）。

2.3 筋膜源性干細胞表面免疫表型特征

間充質(zhì)干細胞表達CD29、CD44、CD71、CD90 等基質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞的特異性標志抗原，而不表達CD34、CD45、CD14 等特異性表面抗原。此次選擇CD29、CD45、CD71、CD90 進行流式細胞儀檢測，其中，筋膜源性干細胞表面CD29 呈陽性表達、筋膜源性干細胞表面CD71呈陽性表達、筋膜源性干細胞表面CD90 呈陽性表達，而筋膜源性干細胞表面CD45呈陰性表達，這一結(jié)果也顯示了分離的筋膜細胞具有間充質(zhì)干細胞的特性（圖2）。

2.4 筋膜源性干細胞的成脂肪誘導(dǎo)分化

誘導(dǎo)分化12 d 后可見部分細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)透亮的微小折光性好的顆粒，并且相互融合，經(jīng)油紅O 染色后呈現(xiàn)紅色（圖3）。

2.5 筋膜源性干細胞的成軟骨誘導(dǎo)分化

3D pellet培養(yǎng)后，筋膜源性干細胞誘導(dǎo)分化組隨著誘導(dǎo)時間的延長，pellet 變圓，變白，形成的團塊形狀與軟骨細胞相近，而未經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)的筋膜源性干細胞pellet 小球，較小且無光澤（圖4A～C）；軟骨細胞組和筋膜源性干細胞誘導(dǎo)分化組的細胞團塊經(jīng)石蠟切片后進行軟骨標志物Ⅱ型膠原蛋白免疫組化顯色，顯微鏡下顯示：Ⅱ型膠原蛋白含量豐富，軟骨細胞數(shù)量較多，團塊邊緣連續(xù)、清晰，而單純的筋膜源干細胞組顯微鏡下顯示其軟骨細胞稀疏，II型膠原蛋白含量低，細胞團塊邊緣連續(xù)性差、清晰度低（圖4）。3個細胞組的細胞團塊直徑之間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.07，P=0.0004），進一步兩兩比較，軟骨細胞組與筋膜源性干細胞誘導(dǎo)分化組的細胞團塊直徑之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），軟骨細胞組與筋膜源性干細胞組、筋膜源性干細胞誘導(dǎo)分化組與筋膜源性干細胞組的細胞團塊直徑差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。隨后對各組pellet 的石蠟切片用免疫組織化學(xué)法檢測Ⅱ型膠原蛋白的表達，并用Image J 對各組結(jié)果分析，軟骨細胞組平均光密度值大于筋膜源性干細胞誘導(dǎo)分化組、筋膜源性干細胞組（P＜0.05），筋膜源性干細胞誘導(dǎo)分化組平均光密度值大于筋膜源性干細胞組（P＜0.05，表1）。

圖2 筋膜源性干細胞免疫表型的單參數(shù)直方圖

圖3 光鏡下成脂肪誘導(dǎo)分化的筋膜源性干細胞

3 討論

當(dāng)前，組織工程技術(shù)的發(fā)展突飛猛進，但在骨與關(guān)節(jié)疾病方面組織工程細胞的來源相對比較局限，骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、滑膜干細胞是應(yīng)用相對較多的種子細胞[8,11-13]。但在取材和分離方面風(fēng)險較多，為利用帶來了諸多難題[14-16]。

圖4 3D pellet 培養(yǎng)至28 d的3組細胞團塊大體觀及細胞團塊石蠟切片后進行軟骨標識物Ⅱ型膠原蛋白免疫組化顯色在40倍和200倍的顯微鏡下觀

間充質(zhì)干細胞治療骨關(guān)節(jié)炎是一種新的選擇，骨髓基質(zhì)細胞、滑膜基質(zhì)細胞、骨膜分離的細胞、脂肪干細胞等在體外成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中均可以見到軟骨組織的形成[17,18]，但由于成分復(fù)雜，純化起來相對困難；間充質(zhì)干細胞的獲取到應(yīng)用相對受限，本研究從大鼠的骨骼肌筋膜中分離出筋膜源性細胞，通過體外3D pellet培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中添加BMP4和TGF-β3進行體外誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)下形成透明的軟骨組織，在外觀上與正常軟骨組織接近，形成的軟骨組織經(jīng)軟骨細胞特異性Ⅱ型膠原蛋白的免疫組化檢測，糖胺聚糖的番紅O 染色、阿爾新蘭染色均顯示軟骨形成的特性，且筋膜源性細胞表達CD29、CD90、CD71，而不表達CD45，本研究證實了從骨骼肌筋膜分離出的非肌源性細胞具有成軟骨分化的能力，筋膜源性細胞與從骨骼肌中分離的肌源性干細胞不同，筋膜源性表達間充質(zhì)干細胞表面分子，而極少表達內(nèi)皮細胞表面分子；筋膜源性細胞從包裹骨骼肌的筋膜中很容易分離，這也使得其成為軟骨修復(fù)可能的間充質(zhì)干細胞來源。間充質(zhì)干細胞治療骨關(guān)節(jié)炎的機制目前還沒有得到充分的解釋[19,20]，目前廣泛接受的合理解釋有2個方面，其一是移植的間充質(zhì)干細胞能夠分化為軟骨細胞并充填于軟骨缺損處[21]，其二是移植的間充質(zhì)干細胞能夠通過旁分泌方式分泌一些細胞因子參與調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)腔的微環(huán)境[22-26]。筋膜源性干細胞的取材來源較廣，分離難度及風(fēng)險相對較低，有較強的成軟骨分化能力，且體外培養(yǎng)時具有較強的增殖能力，這為其日后進行軟骨修復(fù)提供了可能，也為體外大量擴增培養(yǎng)提供可能。

表1 各組細胞團平塊均直光徑密和度石值.（蠟n切=9片，x免±s）疫組織化學(xué)染色

目前將間充質(zhì)干細胞與其他相關(guān)生物材料或生物制劑結(jié)合治療骨關(guān)節(jié)炎已成為越來越引人注目的研究方向，例如將間充質(zhì)干細胞與生物支架或生物材料相結(jié)合協(xié)同治療骨關(guān)節(jié)炎[27]；間充質(zhì)干細胞以不同種類、不同比例搭配混合治療骨關(guān)節(jié)炎[28]；以及間充質(zhì)干細胞與富含血小板的血漿協(xié)同改善骨關(guān)節(jié)炎等[29]，間充質(zhì)干細胞已經(jīng)體現(xiàn)出了其在骨關(guān)節(jié)炎治療上的前景，而在臨床實踐中廣泛使用之前,仍有許多問題需要解決，這要求科研工作者們繼續(xù)發(fā)掘?qū)Ρ炔煌瑏碓吹拈g充質(zhì)細胞及其效果[30]，筋膜源性干細胞的分離和鑒定正與此要求相符，為其提供了另一種選擇及新的研究思路，豐富了細胞治療骨與關(guān)節(jié)疾病的細胞來源，在組織工程中具有很大的應(yīng)用前景。