陳劍平 ，胡兆流 ，黃詩(shī)瑩 ，王佛長(zhǎng) ，鄭 平 ，陳秋谷 ，鄭 琳 ，易鐵鋼 ，張尚斌 ，邢宇鋒 ，韓志毅 ，童光東 ，周大橋 △

（1.廣東省深圳市中醫(yī)院·深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518033； 2.廣東省深圳市中醫(yī)院肝病科肝病研究室，廣東 深圳 518033）

軟肝顆粒是醫(yī)院治療慢性肝病的經(jīng)驗(yàn)方，由醋鱉甲、醋龜甲、麩炒枳殼、丹參、半邊蓮、黃芪等13味中藥組方，具有活血化瘀、軟肝散結(jié)、益氣健脾養(yǎng)陰功效，用于氣血瘀滯、氣陰兩虛所致脅痛、腹脹、口干口苦，尤其適用于肝纖維化、肝硬化的治療[1－7]。本研究中按醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑備案的要求，擬將該方進(jìn)一步研制成顆粒劑。為了全面提取有效活性成分，更好地發(fā)揮療效，根據(jù)處方中所含飲片的不同特性，首先對(duì)醋鱉甲、醋龜甲飲片的先煎工藝進(jìn)行考察[8－9]，確定先煎條件，再根據(jù)處方中其余各飲片的化學(xué)成分和藥理等性質(zhì)[10－13]進(jìn)行合煎水提工藝考察，以水提液中柚皮苷含量和干膏量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司，SIL－20A型自動(dòng)進(jìn)樣器）；CQ－250－DST型超聲波清洗儀（功率為250 W，頻率為40 kHz，深圳和科達(dá)精密清洗設(shè)備股份有限公司）；AUMA220D型分析天平（日本島津公司）；500－2型恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；LD5－2A型低速離心機(jī)（北京京立有限公司）。

試藥：柚皮苷對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為WK916051305，純度不低于98%）；試驗(yàn)所用飲片均購(gòu)自深圳市康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)深圳市中醫(yī)院藥檢室劉紀(jì)青主任鑒定，均符合2015年版《中國(guó)藥典（一部）》各飲片項(xiàng)下的要求；水為純化水，甲醇、乙腈（默克公司）為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 飲片先煎工藝考察

粒度：取醋鱉甲、醋龜甲適量，粉碎成最粗粉、粗粉和中粉，備用；稱取醋鱉甲、醋龜甲飲片、最粗粉、粗粉和中粉各50 g（醋鱉甲、醋龜甲各25 g），分別加入10倍量水，煎煮1 h，放冷，水提液離心，濾過(guò)，定容至 500 mL，量取50 mL水提液，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，干燥，稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。結(jié)果飲片、最粗粉、粗粉、中粉的干膏得率分別為 7.66% ，10.18% ，10.33% ，10.23% ，表明飲片的干膏得率較粉碎低，最粗粉、粗粉、中粉的干膏得率差異不大，考慮到可操作性因素，最終采用最粗粉作為醋鱉甲、醋龜甲的先煎粒度。

時(shí)間：取醋鱉甲、醋龜甲的混合最粗粉3份，每份50 g（醋鱉甲、醋龜甲各25 g），加入10倍量水，分別煎煮0.5，1.0，1.5 h，放冷，水提液離心，濾過(guò)，定容至 500 mL，量取50 mL水提液，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，干燥，稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。結(jié)果先煎 0.5，1.0，1.5 h 的干膏得率分別為 10.39% ，10.45% ，10.60% ，表明煎煮時(shí)間對(duì)醋鱉甲、醋龜甲的干膏得率影響不大，考慮到節(jié)約時(shí)間因素，最終選擇先煎0.5 h作為先煎時(shí)間。

加水倍數(shù)：取醋鱉甲、醋龜甲的混合最粗粉3份，每份 50 g（醋鱉甲、醋龜甲各 25 g），分別加 8，10，12 倍量水，先煎0.5 h，放冷，水提液離心，濾過(guò)，定容至500 mL，量取50 mL濾液，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，干燥，稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。結(jié)果加8，10，12倍量水的干膏得率分別為 7.38% ，10.43% ，10.55% ，表明加水倍數(shù)對(duì)醋鱉甲、醋龜甲的干膏得率影響較大，考慮到節(jié)約用水因素，最終選擇加10倍量水。

2.2 飲片合煎工藝及干膏含量測(cè)定

根據(jù)2.1項(xiàng)下考察結(jié)果，醋鱉甲、醋龜甲采用最粗粉，先煎0.5 h，后加入其余各味飲片合煎，水提液趁熱濾過(guò)，放冷，濾液濃縮至200 mL。采用正交試驗(yàn)法，以水提液中柚皮苷含量和干膏量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)影響提取工藝的加水倍數(shù)（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取次數(shù)（因素 C）進(jìn)行優(yōu)選，因素水平表見表 1。量取濃縮液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，按照干燥失重測(cè)定法（2015年版《中國(guó)藥典(四部)》通則0831）測(cè)定，計(jì)算干膏量。

表1 L9(34)因素水平表

2.3 柚皮苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：AgilentTC －C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈(A)－水(B)，梯度洗脫(0～12 min時(shí)19%A，12.01～35 min 時(shí) 19% → 25%A，35.01～40 min 時(shí)19%A)；流速：0.8 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

精密量取 2.2項(xiàng)下濃縮液 1 mL，加甲醇定容至20 mL，過(guò) 0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取柚皮苷對(duì)照品0.5 mg，精密稱定，加甲醇溶液并定容至1 mL，即得對(duì)照品溶液。稱取缺枳殼的處方量，按2.2項(xiàng)下方法提取濃縮，按供試品溶液制備方法制作陰性對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處有相同色譜峰，而陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與檢出限和定量限測(cè)定：精密吸取柚皮苷對(duì)照品貯備液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋，分別制得質(zhì)量濃度為 3.91 ～500.00 μg ／mL（3.91，7.81，15.62，31.25，62.50，125.00，250.00，500.00 μg ／mL）的系列對(duì)照品溶液，分別量取溶液10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，以柚皮苷峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X，μg／mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程 Y＝20 157.8 X－51 276.6，r＝0.999 9（n＝8）。結(jié)果表明，柚皮苷質(zhì)量濃度在 3.91 ～ 500.00 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。同時(shí)，以峰面積為噪音 3倍（S／N＝3）和10倍（S／N＝10）的進(jìn)樣質(zhì)量濃度分別測(cè)得檢出限為0.25 μg ／mL，定量限為 0.74 μg ／mL。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.15%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取2.3.2項(xiàng)下供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為 1.04%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下提取的同一樣品6份，按2.3.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為1.05%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知質(zhì)量濃度的供試品溶液共9份，分別加入高、中、低3種不同含量的對(duì)照品，每組3份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備待測(cè)溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 柚皮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

按 L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用加權(quán)評(píng)分法分析結(jié)果，設(shè)定水提液的干膏量和柚皮苷的含量加權(quán)系數(shù)分別設(shè)為0.5，綜合評(píng)分值＝（干膏量／干膏量最大值＋柚皮苷含量／柚皮苷含量最大值）×0.5×100，結(jié)果見表 3和表4。由表3可見，提取條件以A3B3C3為佳。為了驗(yàn)證直觀分析結(jié)果，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差分析，結(jié)果表明，因素A和因素C均對(duì)水提工藝中干膏量和柚皮苷含量有顯著性差異。綜合各因素影響水平為煎煮次數(shù)C＞A＞B，從溶劑及節(jié)省時(shí)間考慮，確定最佳提取工藝為 A3B1C3，即加 10 倍量水，煮 3 次，每次煮 1.0 h。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n＝9)

表4 方差分析結(jié)果

2.5 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證所得組合工藝的可行性，進(jìn)行了3批驗(yàn)證試驗(yàn)。取處方量，按優(yōu)選工藝進(jìn)行提取，測(cè)定干膏量及柚皮苷含量，結(jié)果見表5?？梢姡?yàn)證試驗(yàn)綜合評(píng)分值的平均值為 96.15，RSD 為 0.59%(n＝3)，表明正交試驗(yàn)優(yōu)選的條件穩(wěn)定可行，可作為軟肝顆粒的提取工藝。

表5 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3.1 提取工確定

軟肝顆粒方中醋鱉甲具有滋陰潛陽(yáng)、軟堅(jiān)散結(jié)的功效，主要用于肝纖維化的治療；醋龜甲可滋陰養(yǎng)血、益腎健骨，主要用于增強(qiáng)免疫力和促進(jìn)康復(fù)。醋鱉甲、醋龜甲富含人體必需氨基酸、寡肽、微量元素等不易溶于水的物質(zhì)，屬先煎類藥物中甲角類[14－16]，二者活性成分的提取率對(duì)肝纖維化的治療及恢復(fù)具有重大影響。為充分提取醋鱉甲、醋龜甲中有效成分，根據(jù)中藥傳統(tǒng)的提取方法，首先采用單因素試驗(yàn)對(duì)醋鱉甲、醋龜甲的先煎粒度及先煎時(shí)間進(jìn)行考察，再采用正交試驗(yàn)進(jìn)行醋鱉甲、醋龜甲藥液及其藥渣與其余各飲片合煎工藝的考察。對(duì)于提取液的純化，本試驗(yàn)中采用水提濃縮，而非水提醇沉，目的是保持與湯劑一致的化學(xué)組成，保證藥效；同時(shí)，符合《中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥法》中關(guān)于傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑備案工作的要求，以便進(jìn)一步研制成院內(nèi)中藥制劑。

3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇

本研究中首選方中丹參中有效成分丹酚酸B作為提取工藝的篩選指標(biāo)，結(jié)果在相同保留時(shí)間內(nèi)存在干擾，分離度低；通過(guò)改變流速、調(diào)整流動(dòng)相比例及更換不同流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，均無(wú)顯著效果；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，干擾成分來(lái)自半邊蓮所含有的酚酸類[17]，通過(guò)半邊蓮陰性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同保留時(shí)間內(nèi)無(wú)干擾，可以確定干擾成分來(lái)自半邊蓮，但無(wú)法確認(rèn)半邊蓮的干擾成分，故排除丹酚酸B作為指標(biāo)成分。曾對(duì)黃芪中的黃芪甲苷進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)供試品溶液中黃芪甲苷保留時(shí)間內(nèi)同樣存在干擾、分離度低的問(wèn)題，故亦未選取黃芪甲苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.3 不足

經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枳殼中柚皮苷分離度好，紫外吸收強(qiáng)，出峰無(wú)干擾，保留時(shí)間相對(duì)適中，故最終選取柚皮苷含量作為水提工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)[18]。本試驗(yàn)中未能選擇處方中君藥的有效成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，是本研究存在的不足之處，將在后續(xù)研究中進(jìn)行改進(jìn)。本方法操作簡(jiǎn)便，優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定性好、可靠性強(qiáng)，可為進(jìn)一步將軟肝顆粒開發(fā)成中藥制劑提供重要的試驗(yàn)基礎(chǔ)。