韋貴云 ，李 芳 ，黃 程 ，許崇搖 △

(1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，廣西 南寧 530003； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

巴西人參 Pfaffia paniculata Pedersen為莧科巴西人參屬植物，原產(chǎn)于中美洲和南美洲，主要分布于巴西等熱帶雨林氣候帶的原生態(tài)地區(qū)[1]，具有抗腫瘤[2]、抗缺血缺氧、抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)胃黏膜、降血糖等藥理作用。其化學(xué)成分主要有琺菲亞酸及其苷類、三萜苷類、脫皮甾醇類激素(如脫皮甾酮)及苷類等[3]，其中三萜類的齊墩果酸型皂苷是主要有效成分，含量較高，具有抗腫瘤、降血糖血脂、保肝、抑制胰脂肪酶和抗肥胖[4]等作用。有學(xué)者認(rèn)為，可以單體皂苷(人參皂苷Ro)或以皂苷元作為對(duì)照品測(cè)定總皂苷含量[5]，由于使用不同的對(duì)照品，皂苷含量測(cè)定結(jié)果也有不同。本研究中擬提取皂苷與皂苷元，分別采用人參皂苷Ro和齊墩果酸作為對(duì)照品，測(cè)定巴西人參中齊墩果酸型皂苷含量，比較2種方法的差異，為藥材質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：TV－1901型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；ATY224型電子分析天平(日本島津公司)；ZRD－5210型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；R1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

試藥：巴西人參采集于廣西隆安縣廣西寶塔工業(yè)園小林基地，由廣西醫(yī)科大學(xué)朱丹副教授鑒定為莧科植物巴西人參 Pfaffia paniculata pedersen的干燥根，粉碎過(guò)篩干燥后，密封保存，備用；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)為0110088，純度為98%）；人參皂苷Ro標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為 B21068，純度為 98%)；石油醚、正丁醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

皂苷提取液[6]：取藥材粗粉1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入25 mL 80%乙醇回流提取2次，每次90 min，合并2次提取液，回收乙醇得到浸膏，加20 mL水溶解，用石油醚萃取3次，每次10 mL，棄石油醚層，水層用水飽和的正丁醇萃取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，減壓回收正丁醇至干，用甲醇溶解并定容至100 mL。

皂苷元提取液：取巴西人參粗粉1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入25 mL 80%乙醇回流提取2次，每次90 min，過(guò)濾，取濾液，濾液合并減壓濃縮至約12 mL，加20%硫酸和水配成含質(zhì)量體積比為2%H2SO4的溶液25 mL，加熱回流60 min，冷卻析晶，過(guò)濾，濾紙及不溶物用純水洗至中性，產(chǎn)物用甲醇溶解，并定容至50 mL。

對(duì)照品溶液：取人參皂苷Ro對(duì)照品10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，備用。取齊墩果酸對(duì)照品7.5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，備用。

2.2 薄層色譜鑒別

皂苷提取液：以皂苷對(duì)照品和皂苷提取液點(diǎn)板，以三氯甲烷－甲醇－水(12∶7∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇，于105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，雖然皂苷提取液中出現(xiàn)了與人參皂苷Rb1和人參皂苷Ro對(duì)照品比移值(Rf)相近的斑點(diǎn)，但是兩者在10%硫酸乙醇顯色出來(lái)的斑點(diǎn)顏色與皂苷提取液中的斑點(diǎn)顏色均有差異，結(jié)合文獻(xiàn)[7]報(bào)道的化學(xué)成分，并未見(jiàn)有分離到這2個(gè)化合物的報(bào)道，故該兩處顯現(xiàn)的斑點(diǎn)可能不是人參皂苷Rb1和Ro(見(jiàn)圖1)。

皂苷元提取液[8]：以皂苷元齊墩果酸對(duì)照品和皂苷元提取液點(diǎn)板，以三氯甲烷－乙酸乙酯－乙酸(10∶4∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，皂苷提取液經(jīng)過(guò)水解成苷元后，明顯看出齊墩果酸的斑點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。

2.3 最大吸收波長(zhǎng)選擇

精密吸取皂苷和皂苷元提取液各0.2 mL，稀釋為0.4 g／L人參皂苷Ro和齊墩果酸對(duì)照品溶液各0.2 mL，分別置干燥試管中，揮干，加入5%香草醛－冰醋酸溶液 0.2 mL，高氯酸 0.8 mL，置 60 ℃水浴上加熱 15 min，流水冷卻后加入5 mL冰醋酸，搖勻，在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描[7]；另取未加入顯色劑的提取液和對(duì)照品溶液在同樣波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確保無(wú)吸收、干擾，以確定檢測(cè)波長(zhǎng)[8－9]。顯色后，各提取液和對(duì)照品溶液在548 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，而未加入顯色劑的提取液和對(duì)照品溶液在此處無(wú)吸收，故選擇548 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 方法學(xué)考察

顯色后溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)[10]：分別取皂苷樣品溶液和皂苷元樣品溶液適量，揮干，按2.3項(xiàng)下方法操作顯色后，分別在 0，15，30，60，90，120 min 時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果皂苷和苷元提取液吸光度的 RSD分別為1.12%和1.61%（n＝6），表明樣品溶液顯色后在2 h內(nèi)較穩(wěn)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別精密吸取人參皂苷Ro對(duì)照品貯備液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.6 mL，分別置 5 支試管中，按2.3項(xiàng)下操作顯色后，以未加樣品的試劑作空白，在548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝0.008 9 X＋0.004 2，R2＝0.999 5(n＝5)。分別精密吸取齊墩果酸對(duì)照品貯備液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，按上述方法操作，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y＝0.023 4 X－0.001 4，R2＝0.999 5（n＝5）。結(jié)果表明，人參皂苷 Ro與齊墩果酸質(zhì)量濃度分別在 16.83～100.98 μg ／mL 和5.07～30.40 μg ／mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精確吸取對(duì)照品溶液各0.2 mL，按2.3項(xiàng)下操作顯色后，于確定的波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果的 RSD均為0（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品1 g，精密稱定，共10份，分別按皂苷提取液和皂苷元提取液制備方法制備供試品溶液，各5份。按2.3項(xiàng)下方法顯色后，測(cè)定吸光度，計(jì)算皂苷含量。結(jié)果皂苷比色法測(cè)得平均含量為9.86%，RSD為 2.03%（n＝5）；苷元比色法測(cè)得平均含量為3.31%，RSD 為 1.81%（n＝5）。表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)[11]：取6份藥材粗粉各1 g，依法制備皂苷提取液，按2.3項(xiàng)下方法顯色后，于548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算齊墩果酸型皂苷含量，另取5 mL，分別加入提取液含量的80%，100%，120%的人參皂苷Ro對(duì)照品溶液，用甲醇定容于100 mL，每組平行2份。顯色后，測(cè)定，計(jì)算回收率。取6份藥材粗粉各1 g，提取，按2.3項(xiàng)下方法操作顯色后，于548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算1 g巴西人參中齊墩果酸的含量。另取15 mL，分別加入提取液含量的80%，100%，120%的齊墩果酸對(duì)照品溶液，用甲醇定容于50 mL，每組平行2份，顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 樣品含量測(cè)定

皂苷法及皂苷元法：取巴西人參樣品1 g，精密稱定，共取5份，依法提取，按2.3項(xiàng)下方法操作顯色后，于548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算齊墩果酸型皂苷及齊墩果酸含量[12－13]。齊墩果酸型皂苷含量 ＝齊墩果酸含量×齊墩果酸型皂苷平均分子量／齊墩果酸分子量。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

巴西人參中齊墩果酸型皂苷主要有3種[7]，即齊墩果酸－3－O－β－D－葡萄糖醛酸甲酯苷、齊墩果酸－3－O－β－D－葡萄糖醛酸苷、齊墩果酸－28－O－β－D－吡喃葡萄糖酯苷，相對(duì)分子質(zhì)量分別為648，632，618，相差不大，液相峰強(qiáng)度相近，可認(rèn)為藥材中齊墩果酸型皂苷的平均相對(duì)分子質(zhì)量為三者平均值[13]，即632.67。齊墩果酸的相對(duì)分子質(zhì)量為456，齊墩果酸換算成齊墩果酸型皂苷的換算系數(shù)為1.39。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 皂苷比色法與苷元比色法測(cè)定齊墩果酸型皂苷含量結(jié)果(n＝5)

3 討論

齊墩果酸型皂苷為具有明顯藥理活性的天然產(chǎn)物，目前認(rèn)為甲戊二羥酸(MVA)途徑為其主要的生物合成途徑。巴西人參很可能也是通過(guò)MVA途徑合成的皂苷，即以糖酵解產(chǎn)物乙酰輔酶A為起始物，經(jīng)甲戊二羥酸中間體一系列反應(yīng)生成皂苷元齊墩果酸，再經(jīng)過(guò)糖基化等反應(yīng)產(chǎn)生皂苷。合成過(guò)程中，反應(yīng)底物的不同將能形成結(jié)構(gòu)相似而又不完全相同的一系列具有相似活性的代謝產(chǎn)物。因此，天然產(chǎn)物中皂苷的成分較復(fù)雜，難以選用單一或多個(gè)對(duì)照品對(duì)總皂苷含量進(jìn)行評(píng)價(jià)[14]。皂苷的定量測(cè)定常用方法有高效液相色譜法、氣相色譜法和比色法等，前兩者可準(zhǔn)確檢測(cè)各單一成分皂苷的含量；采用構(gòu)型相似的皂苷作為對(duì)照品時(shí)，因其在紫外特定波長(zhǎng)下具有共同的吸收，采用顯色法排除干擾后再用比色法檢測(cè)可得到較為合理的評(píng)價(jià)結(jié)果。

在巴西人參齊墩果酸型皂苷的含量測(cè)定中，人參皂苷Rb1屬原人參二醇型皂苷，人參皂苷Ro屬齊墩果酸型皂苷，選用人參皂苷Ro作為皂苷法測(cè)定的對(duì)照品比用Rb1更合理，但人參皂苷Ro的相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)高于巴西人參中齊墩果酸型皂苷，將使結(jié)果比真實(shí)值要高很多。齊墩果酸型皂苷的水解產(chǎn)物為齊墩果酸，在適宜的水解條件下，參照藥材的化學(xué)成分分析[7]選用齊墩果酸作為苷元法的對(duì)照品測(cè)定巴西人參中齊墩果酸型皂苷的含量，結(jié)果更合理。本研究中采用皂苷法測(cè)得巴西人參中齊墩果酸型皂苷含量為9.956%，苷元法測(cè)得含量為3.232%。凌征柱等[15]研究發(fā)現(xiàn)，巴西人參中總皂苷含量為6.54%?？梢?jiàn)，齊墩果酸型皂苷作為總皂苷的一部分，以苷元比色法測(cè)得的含量更準(zhǔn)確，即巴西人參中齊墩果酸型皂苷的含量為3.232%。